沈丹萍， 戈?yáng)|輝， 陳顯達(dá)， 吳雨晴， 李 磊， 褚茂平

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 育英兒童醫(yī)院， 兒童心臟中心， 溫州醫(yī)科大學(xué)心臟發(fā)育與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325027)

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是成纖維生長(zhǎng)因子家族的一員，在神經(jīng)系統(tǒng)和心臟中表達(dá)豐富，并且具有促進(jìn)血管生成和細(xì)胞增殖遷移等作用[1]。研究表明，外源性bFGF能夠減輕腦損傷患者腦水腫，保護(hù)血腦屏障的完整性；同樣，在脊髓損傷患者中，它能夠保證血-脊髓屏障的完整性[2-3]。在心肌缺血再灌注模型中，bFGF能夠通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB，即AKT)信號(hào)通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和過(guò)度的自噬反應(yīng)， 以及清除過(guò)多的泛素化蛋白從而來(lái)減輕心臟的損傷[4-5]。bFGF也能促進(jìn)急性心梗時(shí)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，減少心肌凋亡[6]。另有研究表明， bFGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管新生。Nakamichi等[7]研究發(fā)現(xiàn)了bFGF能夠促進(jìn)小鼠的皮膚損傷處血管新生。雖然已有幾項(xiàng)研究表明bFGF能夠促進(jìn)急性心肌缺血區(qū)血管新生，改善左心室功能[8]，但其對(duì)于慢性心肌梗死的作用及其深入機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)復(fù)制小鼠心肌梗死模型，觀察bFGF能否通過(guò)AKT通路激活下游的缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白，從而促進(jìn)心臟梗死區(qū)微血管新生，改善心肌重構(gòu)和心功能。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)C57/B6小鼠，雄性，8～12周齡，18～20 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2015-0009。

2 主要試劑

bFGF購(gòu)自浙江生物技術(shù)和制藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；Masson染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自上海碧云天公司；抗p-AKT、 AKT和HIF-1α抗體及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自CST；抗VEGF抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗CD31抗體購(gòu)自Abcom；ECL 顯色液購(gòu)自Advansta；異氟烷購(gòu)自瑞沃德公司；冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線購(gòu)自寧波成和公司；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1小鼠心肌梗死模型的建立 用異氟烷吸入麻醉小鼠，直視下氣管切開(kāi)，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，左側(cè)第4 肋間入胸，識(shí)別前降支走行范圍，7/0滑線結(jié)扎前降支，當(dāng)左心室前壁部分顏色轉(zhuǎn)為蒼白，確認(rèn)小鼠心梗模型成功之后一直維持血管結(jié)扎，結(jié)扎位置基本相同； 假手術(shù)(sham)組用7/0滑線穿過(guò)前降支下面而不結(jié)扎； bFGF治療組于造模成功7 d后隔天腹腔注射給藥，每只5 μg，直至28 d，總共給藥10次。

3.2超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 心梗后7 d及28 d時(shí)，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，取仰臥位。使用西門子ACUSON SEQUOIA 512彩色超聲診斷儀檢查小鼠心功能，探頭頻率為12～14 Mz。取左心室乳頭肌水平二維左室短軸切面，記錄左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)及左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)，由超聲心動(dòng)圖電腦自動(dòng)計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)，取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

3.3心肌組織Masson染色 實(shí)驗(yàn)小鼠28 d后脫頸椎處死， 立即開(kāi)胸取心臟，放入PBS中(冰上預(yù)冷)，將血液擠干凈，將心室組織做石蠟切片，之后常規(guī)脫蠟入水，蒸餾水沖洗干凈滴入麗春紅液染4 min；再次蒸餾水流水沖洗干凈，滴入磷鉬酸液染2 min；甩干液體后用苯胺藍(lán)液染7 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

3.4免疫熒光染色觀察 將上述各組小鼠心臟組織OCT包埋后做冰凍切片，室溫復(fù)溫30 min后PBS清洗3次，擦干之后加5% BSA室溫封閉30 min。然后用抗CD31抗體(1∶200)4 °C孵育過(guò)夜。用PBS-Tween洗3遍后，用Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶500)在37 ℃孵育1 h，PBS-Tween洗4次后，DAPI染色7 min，PBS-Tween洗4次后擦干加抗熒光淬滅劑后封片。熒光顯微鏡下拍照。

3.5Western blot 實(shí)驗(yàn) 小鼠脫頸椎處死后立即開(kāi)胸取心臟，放入PBS中(冰上預(yù)冷)，將血液擠干凈，保留冠脈結(jié)扎線以下左室心肌組織， 稱量后放入有裂解液(含蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑)的勻漿管中，勻漿機(jī)裂解心肌組織，冰上裂解30 min，離心后超聲3次，每次間隔1 min，12 000×g、4 ℃離心30 min后取上清行BCA法蛋白定量，準(zhǔn)備蛋白樣品。用10% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，加 I 抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBS-Tween 洗3 次，加HRP 偶聯(lián) II 抗于室溫孵育2 h，TBS-Tween 洗3 次，加ECL 液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 bFGF改善心肌梗死后心肌纖維化程度

根據(jù)Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 28 d后心肌梗死組心肌組織出現(xiàn)明顯的心肌纖維化，而bFGF給藥組能夠有效減少心肌纖維化程度(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2 bFGF改善心肌梗死后的心功能

超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，心肌梗死組各項(xiàng)心功能比正常假手術(shù)組較差，bFGF組能顯著改善心肌梗死28 d后小鼠心功能，與MI組相比， bFGF組能有效減少左室收縮期末內(nèi)徑(P<0.05)，LVEF和LVFS值明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 1. Myocardial tissues with Masson staining at 28 d after MI (×400). Mean±SD.n=3.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖1心肌梗死28d后心肌組織的Masson染色結(jié)果

Figure 2. The results of echocardiography at 28 d after MI. Mean±SD.n=10.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖2心肌梗死28d后的超聲心動(dòng)圖結(jié)果

3 bFGF促進(jìn)梗死區(qū)組織血管新生

CD31是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)對(duì)梗死區(qū)組織中的CD31進(jìn)行免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)梗死區(qū)微毛細(xì)血管的數(shù)量。在高倍鏡下，梗死區(qū)域可見(jiàn)MI組的血管密度比sham組的低，而bFGF給藥組的血管密度比MI組高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 bFGF激活心肌AKT/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路

已有研究報(bào)道在血管內(nèi)皮缺氧的情況下，能夠上調(diào)PI3K/AKT/HIF-1α信號(hào)通路的活性，從而能夠改善血管內(nèi)皮細(xì)胞抗缺氧損傷的作用[9]。因此我們推測(cè)bFGF也能夠通過(guò)該通路促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，我們檢測(cè)了第10天時(shí)小鼠心肌中AKT、HIF-1α以及其靶蛋白VEGF的蛋白水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第10天時(shí)心梗組AKT磷酸化水平比假手術(shù)組要高(P<0.05)，但是HIF-1α及VEGF蛋白水平和假手術(shù)組比較差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而與心梗組比較，bFGF給藥組的HIF-1α(P<0.05)及VEGF(P<0.05)的蛋白水平更高，心梗28 d后的蛋白變化趨勢(shì)跟第10天的蛋白變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明bFGF通過(guò)隔天腹腔給藥能夠激活A(yù)KT/HIF-1α/VEGF通路，見(jiàn)圖4。

Figure 3. Myocardial tissues with CD31 immunofluorescence staining at 28 d after MI (×200). Mean±SD.n=3.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖3心肌梗死28d后小鼠心肌病理切片的CD31免疫熒光染色

Figure 4. The levels of AKT/HIF-1α/VEGF signaling pathway-related proteins at 10 d and 28 d after MI.Mean±SD.n=3 .#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖4心肌梗死第10天及第28天后各組AKT/HIF-1α/VEGF通路相關(guān)蛋白水平的變化

討 論

隨著心肌梗死發(fā)病率和致死率的逐年攀升，已成為嚴(yán)重威脅全球人民的身體健康。急性期心肌梗死主要的死亡原因是急性心衰竭，隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，內(nèi)科藥物溶栓、介入支架和外科的搭橋手術(shù)使急性期心梗發(fā)展成急性心衰進(jìn)而導(dǎo)致死亡的幾率大幅度下降。但隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展可轉(zhuǎn)為慢性期。慢性期主要以心臟纖維化重塑為主，如果纖維重塑過(guò)度會(huì)引發(fā)慢性心衰導(dǎo)致死亡。然而，到目前為止預(yù)防和治療心臟纖維化重塑過(guò)度尚無(wú)好的方法[10]。

近年來(lái)用外源性蛋白因子促進(jìn)血管新生可能成為一種有效治療心肌缺血的辦法。bFGF在心臟呈高表達(dá)，具有較強(qiáng)的促內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用。研究表明， 心肌內(nèi)注射外源性bFGF，能有效減少梗死面積，促血管新生[11]。但該給藥途徑具有創(chuàng)傷性，因此本研究采用了腹腔隔天注射給藥，對(duì)該方法進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隔天腹腔注射給藥也能有效提高小鼠心功能，并且能夠減少心肌纖維化。

持續(xù)表達(dá)HIF-1α能夠減少心臟梗死區(qū)域，促進(jìn)心梗邊緣區(qū)新生血管形成，從而改善心肌重構(gòu)[12]。心肌缺血雖然能夠促進(jìn)HIF-1α表達(dá)增加，但是這種代償性適應(yīng)是暫時(shí)性的，HIF-1α在心梗后期表達(dá)量將趨于正常[13]。在組織缺氧環(huán)境下，作為HIF-1α的靶蛋白， VEGF能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管形成，從而部分緩解組織缺血[14]。已有研究表明，bFGF在急性心肌梗死后，能夠增加HIF-1α和VEGF的mRNA水平[15]。本研究發(fā)現(xiàn)bFGF能夠促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管新生，并深入研究了血管新生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組心肌中AKT磷酸化水平、HIF-1α及VEGF蛋白水平明顯比心梗組要高，也說(shuō)明了bFGF可能通過(guò)激活該通路促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管新生，從而改善心肌纖維化保護(hù)心功能。

本實(shí)驗(yàn)的最大局限之處是沒(méi)有設(shè)立bFGF抑制劑組，在血管新生機(jī)制研究方面，發(fā)現(xiàn)bFGF能夠激活A(yù)KT/HIF-1α/VEGF通路，但是不能夠說(shuō)明一定是通過(guò)該通路促進(jìn)梗死邊緣區(qū)的血管新生，或者該通路可能協(xié)同其它通路共同參與血管新生的作用。因此對(duì)于bFGF促進(jìn)心肌梗死邊緣區(qū)血管新生的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究采用建立小鼠心肌梗死模型，隔天腹腔注射 bFGF，發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組比心梗組的心功能有好轉(zhuǎn)，心肌纖維化減少，梗死邊緣區(qū)新生血管增多；并且發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組能夠提高AKT/HIF-1α/VEGF的蛋白水平，提示bFGF可能通過(guò)該通路促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管新生，保護(hù)心臟。

[1] Ornitz DM, Itoh N. Fibroblast growth factors[J]. Genome Biol, 2001, 2(3):REVIEWS3005.

[2] Wang ZG, Cheng Y, Yu XC, et al. bFGF protects against blood-brain barrier damage through junction protein regulation via PI3K-Akt-Rac1 pathway following traumatic brain injury[J]. Mol Neurobiol, 2016, 53(10):7298-7311.

[3] Ye LB, Yu XC, Xia QH,et al. Regulation of caveolin-1 and junction proteins by bFGF contributes to the integrity of blood-spinal cord barrier and functional recovery[J]. Neurotherapeutics, 2016, 13(4):844-858.

[4] Wang Z, Zhang H, Xu X, et al. bFGF inhibits ER stress induced by ischemic oxidative injury via activation of the PI3K/Akt and ERK1/2 pathways[J]. Toxicol Lett, 2012, 212(2):137-146.

[5] Wang ZG, Wang Y, Huang Y, et al. bFGF regulates autophagy and ubiquitinated protein accumulation induced by myocardial ischemia/reperfusion via the activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway[J]. Sci Rep, 2015, 5:9287.

[6] 陳吉田， 陳昌捷. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)急性心肌梗死時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 18(4):420-422.

[7] Nakamichi M, Akishima-Fukasawa Y, Fujisawa C, et al. Basic fibroblast growth factor induces angiogenic properties of fibrocytes to stimulate vascular formation during wound healing[J]. Am J Pathol, 2016, 186(12):3203-3216.

[8] 姜志勝， 王曉紅， 符民桂， 等. 內(nèi)源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是大鼠對(duì)抗心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)因子[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2000, 16 (3):7-11.

[9] 梁俊清， 徐海波， 陳小娟， 等. 通心絡(luò)通過(guò)PI-3K/AKT/HIF信號(hào)通路改善血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(5):846-851.

[10] Struthers AD. Pathophysiology of heart failure following myocardial infarction[J]. Heart, 2005, 91(Suppl 2): ii14-ii16; discussion ii31, ii43-ii48.

[11] Jiang ZS, Padua RR, Ju H, et al. Acute protection of ischemic heart by FGF-2: involvement of FGF-2 receptors and protein kinase C[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002, 282(3):H1071-H1080.

[12] Kido M, Du L, Sullivan CC, et al. Hypoxia-inducible factor 1-α reduces infarction and attenuates progression of cardiac dysfunction after myocardial infarction in the mouse[J]. J Am Coll Cardiol, 2005, 46(11):2116-2124.

[13] Lee SH, Wolf PL, Escudero R, et al. Early expression of angiogenesis factors in acute myocardial ischemia and infarction[J]. N Engl J Med, 2000, 342(9):626-633.

[14] Giles FJ. The vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway: a therapeutic target in patients with hematologic malignancies[J]. Oncologist, 2001, 6(Suppl 5):32-39.

[15] Yao HC, Liu T, Meng XY, et al. Effect of basic fibroblast growth factor on the myocardial expression of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor following acute myocardial infarction[J]. Heart Lung Circ, 2013, 22(11):946-951.