李兆慧，高興興，喻曉雁，阮曉，王強*

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院生化分院，浙江 寧波 315100)

紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)又名紫杉，為常綠喬木或灌木植物。紅豆杉屬植物全世界有11個種，主要分布于北半球溫帶、寒溫帶以及熱帶、亞熱帶高山地區(qū)[1-2]。紅豆杉屬植物中主要有三大類物質(zhì)，分別是以紫杉醇、10-DAB、三尖杉寧堿為代表的紫杉烷類化合物、紫杉黃酮及紅豆杉多糖[1,3]。1971年，Wani等最早從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)中分離得到Taxol，并證實其具有顯著的抗腫瘤活性[4]。此后，紫杉醇因其在乳腺癌、卵巢癌治療等方面取得的良好效果得到廣泛關(guān)注和深入研究。目前工業(yè)制備紫杉醇一般以紅豆杉枝葉為原料,提取10-DAB半合成紫杉醇和多西紫杉醇。在提取制備10-DAB的過程中，剩余大量的紅豆杉枝葉紫杉烷類萃余物(TREFT)[5]已被證實含有豐富的黃酮類化合物。黃酮類化合物具有抗癌[6]、抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、清除自由基[9]、抗心血管疾病[10]等獨特的生物活性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)。

目前已從紅豆杉屬植物中分離鑒定出20余種黃酮類及雙黃酮類化合物[1]，包括阿曼托黃酮[11]、槲皮素[12]、銀杏素[13]、金松雙黃酮[13]、榧雙黃酮[13]等。為充分開發(fā)利用工業(yè)廢棄物TREFT，本課題組深入研究南方紅豆杉枝葉TREFT中的黃酮苷類化合物，并分離鑒定3種黃酮苷化合物，分別為山奈酚3-O-β-D-鼠李糖(1?→6″)-β-D-葡萄糖苷(1)、槲皮素3-O-蕓香糖苷(2)、山奈酚 3-O-α-L-阿拉伯糖(1?→6″)-β-D-葡萄糖苷(3)，其中化合物1和3首次從紅豆杉屬植物中分離得到。

1 材料

1.1 材料和試劑

TREFT粉末由寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司提供，置干燥器內(nèi)室溫保存。

柱色譜硅膠(100～200目)、GF254薄層層析硅膠(青島海洋化工廠)；AB-8大孔吸附樹脂(上海摩速學(xué)器材有限公司)；ODS填料(50 μm，YMC公司)；乙腈(Tedia公司，色譜純)；分析純試劑(北京化學(xué)試劑公司)；氘代甲醇(Aladdin試劑有限公司)；三蒸水(自制)。

1.2 儀器

Agilent 1290 infinity超高效液相色譜儀(DAD二極管陣列檢測器，Agilent ZORBAX Eclipse C18柱,2.1 mm×150 mm,1.8 μm，美國Agilent公司)；UV1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)； Bruker Avance AV 400超導(dǎo)核磁共振譜儀(Brucker公司)；Brucker micro OTOF-Q質(zhì)譜儀(Brucker公司)；AL204電子分析天平(梅勒特-托利多儀器有限公司)。

2 提取與分離

800 g TREFT粉末，料液比1∶20 g/mL加70%乙醇，45℃下超聲提取30 min，提取3次，提取液減壓濃縮至1 L，石油醚除去色素、油脂等，即得紫杉黃酮粗提物(22.07 g)。紫杉黃酮粗提物經(jīng)AB-8大孔樹脂，依次用3 BV 10%、40%、60%乙醇梯度洗脫，流速2 BV/h，UPLC檢測合并得3個部位Fr.1、Fr.2、Fr.3。Fr.2經(jīng)硅膠柱色譜(100～200目)，依次用乙酸乙酯：甲醇(15∶1，9∶1，0∶1)洗脫，UPLC檢測合并得到3個部位Fr.2-1、Fr.2-2、Fr.2-3。Fr.2-2經(jīng)重結(jié)晶技術(shù)得化合物1(28.3 mg)。Fr.2-3經(jīng)減壓ODS柱，依次用甲醇-水(1∶9，4∶5，5∶4，7∶3)洗脫，UPLC檢測合并，經(jīng)重結(jié)晶技術(shù)得化合物2(36.2 mg)和化合物3(15.7 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，黃色粉末，分子式為C27H30O15，ESI-MS (m/z)=593.2 [M-H]-。1H-NMR(Methanol-d4，600 MHz)δ：8.06(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，6.39(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.11(1H，d，J=7.1 Hz，H-1″)，4.52(1H，br，s，H-1?)，3.81(1H，d，J=10.5 Hz，H-6″)，1.13(3H，d，J=6.2 Hz，H-6?)。13C-NMR(Methanol-d4，151 MHz)δ：180.56(C-4)，167.45(C-7)，164.15(C-5)，162.70(C-9)，160.57(C-4′)，159.72(C-2)，136.75(C-3)，133.61(C-2′，6′)，123.96(C-1′)，117.38(C-3′，5′)，106.79(C-10)，105.96(C-1″)，103.64(C-1?)，101.31(C-6)，96.22(C-8)，79.38(C-4″)，78.40(C-5″)，76.97(C-3″)，75.15(C-2″)，73.50(C-3?)，73.30(C-4?)，72.64(C-2?)，70.96(C-5?)，69.81(C-6″)，19.15(C-6?)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[14]，故鑒定化合物1為山奈酚3-O-β-D-鼠李糖(1?→6″)-β-D-葡萄糖苷。

化合物2，黃色粉末，分子式為C27H30O16，ESI-MS(m/z)=609.1 [M-H]-。1H-NMR(Methanol-d4，400 MHz)δ：7.80-7.58(m，2H，H-2′，6′)，6.90(1H，d，J=8.3 Hz，H-5′)，6.42(1H，s，H-8)，6.23(1H，s，H-6)，5.13(1H，d，J=7.4 Hz，H-1″)。13C-NMR(Methanol-d4，151 MHz)δ：180.58(C-4)，167.36(C-7)，164.13(C-5)，160.54(C-9)，159.70(C-2)，151.03(C-3′)，147.03(C-4′)，136.85(C-3)，124.81(C-6′)，124.33(C-1′)，118.94(C-5′)，117.30(C-2′)，106.80(C-10)，105.98(C-1″)，103.64(C-1?)，101.25(C-6)，96.17(C-8)，79.39(C-5″)，78.40(C-3″)，76.95，(C-2″)，75.17(C-4?)，73.47(C-4″)，73.32(C-2?)，72.61(C-3?)，70.94(C-5?)，69.79(C-6″)，19.13(C-6?)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[15-17]，故鑒定化合物2為槲皮素3-O-蕓香糖苷。

化合物3，黃色粉末，分子式為C26H28O15，ESI-MS (m/z)=579.2 [M-H]-。1H-NMR(Methanol-d4，400 MHz)δ：8.02(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，6.80(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，6.32(1H，s，H-8)，6.11(1H，s，H-6)，5.10(1H，d，J=7.5 Hz，H-1″)，3.96(1H，d，J=6.9 Hz，H-1?)，3.82(1H，m，H-6″)。13C-NMR(Methanol-d4，151 MHz，)δ：179.49(C-4)，166.22(C-7)，163.08(C-5)，161.69(C-4′)，158.83(C-9)，158.56(C-2)，135.62(C-3)，132.35(C-2′，6′)，122.74(C-1′)，116.28(C-3′，5′)，105.76(C-10)，104.83(C-1?)，104.13(C-1″)，100.00(C-6)，94.92(C-8)，78.11(C-5″)，78.03(C-3″)，75.79(C-2″)，74.06(C-3?)，72.39(C-2?)，71.47(C-4″)，69.49(C-6″)，69.17(C-4?)，66.61(C-5?)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[18]，故鑒定化合物3為山奈酚3-O-α-L-阿拉伯糖(1?→6″)-β-D-葡萄糖苷。

[1] 王亞飛,王強,阮曉,等.紅豆杉屬植物資源的研究現(xiàn)狀與開發(fā)利用對策[J].林業(yè)科學(xué),2012,48(5):116-125.

[2] 檀麗萍,陳振峰,中國紅豆杉資源[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2006,21(6):113-117.

[3] 劉建慧，馬生軍，馬留純，等.海南和四川不同生長年限曼地亞紅豆杉3種紫彬烷類活性成分的比較研究[J].中醫(yī)藥信息，2017,34(6):9-13.

[4] WANI M C,TAYLOR H L,WALL M E,et al.Plant antitumor agents.6.Isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia[J].J Am Chem Soc,1971,93(9):2325-2327.

[5] RUAN X,ZHAN L M,GAO X X.Separation and purification of flavonoid from Taxus remainder extracts free of taxoids using polystyrene and polyamide resin[J].J Sep Sci,2013(36):1925-1934.

[6] HADDAD A Q,VENKATESWATAN V,VISWANATHAN L,et al.Novel antiprolife-rative flavonoids induce cell cycle arrest in human prostate cancer cell lines[J].Prostate Cancer Prostatic Dis,2006,9(1):68-76.

[7] BRUSSELMANS K,VROLIX R,VERHOEVEN G,et al.Induction of cancer cell apoptosis by flavonoids associated associated with their ability to inhibit fatty acid synthase activity[J].J Bio Chem,2005,280(7):5636-5645.

[8] ABRAHAM L C N,MASAKUNI T,ISAO H,et al.Antioxidant flavonoid glycosides from the leaves of Ficus pumila L[J].Food Chem,2008,109(2):415-420.

[9] BEN AMMAR R,BHOURI W,BEN SGHAIER M,et al.Antioxidant and free radical-scavenging properties of three flavonoids isolated on the leaves of Rhamnus alaternus L.(Rhamnaceae):A structure-activity relationship study[J].Food Chem,2009,116(1):258-264.

[10] AVIRAM M,FUHRMAN B.Wine flavonoids protect against LDL oxidation and athemsclemsis[J].Ann N Y Acad Sci,2002,957:146-161.

[11] 邱林剛.西藏紅豆杉的雙黃酮[J].植物學(xué)報,1989,31(1):54-56.

[12] TACHIBANA S,MATSUO A,ITOH K,et al.Extractives in the leaves and bark of Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.var.nana Rehder[J].Mokuzai Gakkaishi,1994,40(9):1008-1013.

[13] TATSUO K,TOKUNOSUKE S.Flavonoids of the leaves of Coniferae and allied plants.I.Flavonoid from the leaves of Torreya nucifera[J].Yakugaku Zasshi,1958(78):1010-1013.

[14] FALODUN A,QADIR M I,CHOUDHARY M I.Isolation and characterization of xanthine oxidase inhibitory constituents of Pyrenacantha staudtii[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2009,44(4):390-394.

[15] DAI X,HUANG Q,ZHOU B,et al.Preparative isolation and purification of seven main antioxidants from Eucommia ulmoides Oliv.(Du-zhong) leaves using HSCCC guided by DPPH-HPLC experiment[J].Food chemistry,2013.

[16] KAZUMA K,NODA N,SUZUKI M.Malonylated flavonol glycosides from the petals of Clitoria ternatea[J].Phytochemistry,2003,62(2):229-237.

[17] MAJINDA R R T,MOTSWALEDI M,WAIGH R D,et al.Phenolic and antibacterial constituents of Vahlia capensis[J].Planta medica,1997,63(3):268-270.

[18] XIE C,VEITCH N C,HOUGHTON P J,et al.Flavonoid glycosides and isoquinolinone alkaloids from Corydalis bungeana[J].Phytochemistry,2004,65(22):3041-3047.