母曉藝，宋艷華 ，張 蒂 ，孫佳琳 ，譚奇紋△

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

近年來(lái)，隨著生活水平的提高，缺血性心肌病發(fā)病率逐漸上升，危害著人類的健康。臨床心肺復(fù)蘇、溶栓治療、心臟外科體外循環(huán)、心臟移植等方法的應(yīng)用使缺血的心肌組織能夠得到及時(shí)的再灌注，但有時(shí)再灌注反而會(huì)進(jìn)一步加重組織損傷，導(dǎo)致組織和器官的功能障礙，稱為缺血再灌注損傷。心肌缺血再灌注后氧自由基生成增多，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，并引發(fā)炎癥反應(yīng)，這些因素都會(huì)直接或間接造成心肌細(xì)胞損害。大量臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)內(nèi)關(guān)穴具有特異性治療心系疾病的特征，針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，減輕病理?yè)p害。本研究對(duì)針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理治療心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)的機(jī)制研究進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)的綜述。

1 減少自由基

心肌缺血再灌注發(fā)生時(shí)，由于缺氧、應(yīng)激、細(xì)胞損害等原因自由基生成過(guò)多，超出機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的代償能力，細(xì)胞的各種成分如膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等可與自由基發(fā)生反應(yīng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而影響細(xì)胞正常生理功能。在早期，自由基與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，引起膜脂質(zhì)微環(huán)境的紊亂，其產(chǎn)物丙二醇(Malonaldehyde, MDA)可增加細(xì)胞膜通透性，引發(fā)Ca2+內(nèi)流，加重細(xì)胞損害。Zhang等[1]發(fā)現(xiàn)針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以有效激活氧自由基清除系統(tǒng)，增加過(guò)氧化物分解酶——谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的含量，減輕心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。Nrf2-ARE信號(hào)通路是激活抗氧化酶的關(guān)鍵通路。自由基含量增多時(shí),氧化劑刺激Nrf2蛋白從胞漿穩(wěn)定體中解離，進(jìn)入細(xì)胞核。其與ARE結(jié)合激活通路并作用于下游相關(guān)抗氧化酶基因，從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。邵明璐等[2]發(fā)現(xiàn)內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理后血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性升高，Nrf2及HO-1基因表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞損害減輕；針刺內(nèi)關(guān)穴可上調(diào)Nrf2-ARE信號(hào)通路，從而帶動(dòng)下游抗氧化酶的表達(dá)以提升氧自由基清除能力，起到保護(hù)心肌的作用。

2 減輕炎癥損害

炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注過(guò)程中扮演了重要的角色。缺血再灌注發(fā)生期間，白細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞)明顯增加，其浸潤(rùn)數(shù)目越多，對(duì)心肌組織造成的損害越嚴(yán)重[3]。激活的中性粒細(xì)胞可釋放大量的致炎物質(zhì)，造成自身及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。針刺內(nèi)關(guān)穴可通過(guò)多種細(xì)胞信號(hào)途徑，抑制趨化因子和黏附因子的釋放，減少白細(xì)胞聚集，同時(shí)調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)的釋放，保護(hù)微血管，具體作用如下。

2.1 減少白細(xì)胞聚集

缺血再灌注期間，細(xì)胞黏附分子和炎性因子如血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等生成增多[4]，誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮，白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用，造成細(xì)胞損害和微循環(huán)障礙。胡惠林等[5]發(fā)現(xiàn)針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以明顯降低炎癥相關(guān)蛋白TNF-α、VCAM-1、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(NF-κB)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)，控制炎癥反應(yīng)。邵忠華等[6]研究發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)穴可以通過(guò)降低高遷移率族蛋白1( high mobility group box 1,HMGB1)的表達(dá)，減輕心肌組織內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。HMGB1是一種重要的“晚期”炎性細(xì)胞因子，不僅能促使TNF-α、IL-1等促炎因子的表達(dá)，還能激活MAPK信號(hào)通路促使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)生核移位[7]，NF-κB的激活能夠活化炎性細(xì)胞因子[8]，因此抑制HMGB1蛋白的表達(dá)能夠減輕炎癥反應(yīng)。同時(shí)，錢(qián)鋼等[9]的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)針刺內(nèi)關(guān)穴對(duì)HMGB1蛋白的抑制作用與JAK/STAT通路的激活密切相關(guān)。

2.2 保護(hù)微血管

再灌注期間縮血管物質(zhì)大量釋放，舒張血管的物質(zhì)合成受到抑制，引起微血管循環(huán)障礙并可能引發(fā)無(wú)復(fù)流現(xiàn)象。王雙昆等[10]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠發(fā)生心肌缺血再灌注損傷后，具有強(qiáng)大的收縮血管及誘導(dǎo)血小板聚集作用的血漿內(nèi)皮素(ET)、血栓素(TXB2)含量升高；具有舒張血管及抗血小板聚集作用的6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)相對(duì)減少。針刺內(nèi)關(guān)可調(diào)節(jié)以上的血管活性物質(zhì)，改善微血管舒縮，增加心肌血氧供應(yīng)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)不同頻率電針對(duì)血管活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用不完全相同；NO具有舒張血管的功能，采用高頻電針預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴，相較低頻電針，血清NO升高更為明顯，而ET、TXB2及6-keto-PGF1α的變化無(wú)明顯差異。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)具有強(qiáng)大的血管擴(kuò)張作用[11]，再灌注時(shí)其過(guò)量的釋放會(huì)引起血管的過(guò)度擴(kuò)張，加重心肌的再灌注損傷。林亞平等[12]發(fā)現(xiàn)，電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可有效降低再灌注后血漿內(nèi)CGRP的含量，使其維持在一個(gè)相對(duì)較高的濃度，發(fā)揮舒張血管的有利作用，且高頻電針作用下CGRP下降更為明顯，其維持的濃度更有利于心肌細(xì)胞的保護(hù)，減輕MIRI。

3 減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載

缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞Na+-Ca2+交換異常，Ca2+內(nèi)流增加及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放導(dǎo)致鈣超載。鈣超載不僅加重細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，還可引起心肌纖維過(guò)度收縮，引發(fā)再灌注性心律失常。針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可有效降低缺血心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，減輕鈣超載[13]袁葉等[14]證實(shí)針刺內(nèi)關(guān)穴可明顯提高血清鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)的含量，促進(jìn)CRT表達(dá)的上調(diào)，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，減輕鈣超載[15],保護(hù)心肌細(xì)胞。田岳鳳等[16]進(jìn)一步從基因角度證實(shí)針刺內(nèi)關(guān)穴可提高CRTmRNA的表達(dá)率，幫助維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定。CaMKⅡ是一種Ca2調(diào)節(jié)酶，鈣超載時(shí)其活性增強(qiáng)。CaMKⅡ可作用于肌漿網(wǎng)上的不同受體，控制肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子的釋放與吸收，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載并恢復(fù)心肌細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)[17]。針刺內(nèi)關(guān)穴可調(diào)節(jié)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表達(dá)，減輕鈣超載，同時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞其到良好的保護(hù)作用[18]。

4 抑制細(xì)胞凋亡

心肌缺血再灌注期間內(nèi)環(huán)境的改變促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這種病理上的變化會(huì)進(jìn)一步加重MIRI。影響凋亡進(jìn)程的相關(guān)基因中Bcl-2有抑制細(xì)胞凋亡的作用，其同源水溶性蛋白Bax是人體重要的凋亡基因，針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可提高Bcl-2的表達(dá)水平，同時(shí)抑制Bax，擴(kuò)大Bcl-2/Bax的比值以減少凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞[19]。其作用途徑主要是通過(guò)切斷外源性信號(hào)傳遞、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)等影響介導(dǎo)凋亡的因子。在外源性信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中Fas蛋白與Fas配體(Fas-L)結(jié)合將凋亡信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，引起凋亡蛋白酶、限制性內(nèi)切核酸酶的活化以裂解細(xì)胞蛋白，降解DNA片段并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。林海波等[21]證實(shí)針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可抑制Fas/Fas-L蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，且具有48 h的延遲相保護(hù)效應(yīng)，可為臨床針刺介入時(shí)間提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。線粒體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器。缺血再灌注時(shí)，由于內(nèi)環(huán)境的改變，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)持續(xù)開(kāi)放、線粒體膜電位降低、磷脂膜結(jié)構(gòu)破壞使促凋亡分子如細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，經(jīng)一系列酶促反應(yīng)激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase,凋亡蛋白)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。MPTP在線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中扮演著重要的角色，再灌注時(shí)期細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、自由基聚集等因素會(huì)導(dǎo)致MPTP的開(kāi)放，馮果等[23]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴可激活心肌細(xì)胞膜上的蛋白激酶C(PKC)，PKC啟動(dòng)ATP敏感性鉀通道(KATP)，K+外流增加進(jìn)而抑制Ca2+內(nèi)流，在減輕胞內(nèi)Ca2+超載同時(shí)抑制MTPTP的開(kāi)放，減輕細(xì)胞凋亡。針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理在再灌注時(shí)期提高SOD的活性、減輕自由基在心肌組織中的聚集的作用對(duì)線粒體有良性的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)針刺后線粒體水腫減輕，線粒體膜電位上升并趨于穩(wěn)定，MPTP開(kāi)放減少，從而減少心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[24,25]。缺血再灌注時(shí)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成、加工蛋白質(zhì)的功能受到影響，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白增多，觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)[26]以分解錯(cuò)誤蛋白，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤蛋白積累過(guò)多，超出細(xì)胞代償能力，將引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。Caspase-12、CHOP蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均與ERS密切相關(guān)。翟昌林等[27]發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)預(yù)處理可以抑制ERS，減少心肌細(xì)胞caspase-12、CHOP蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

5 調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞的一種程序性保護(hù)機(jī)制，在溶酶體酶的作用下降解錯(cuò)誤蛋白、受損細(xì)胞器并對(duì)其成分進(jìn)行再循環(huán)利用以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，自噬作用過(guò)多或過(guò)少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Beclin 1基因是調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵基因，心肌缺血、缺氧時(shí)Beclin 1基因表達(dá)無(wú)明顯變化而再灌注時(shí)期其表達(dá)顯著升高，抑制這種過(guò)度表達(dá)可降低心肌細(xì)胞的死亡率[28]。此外Beclin 1基因與抗凋亡基因bcl-2可互相影響彼此介導(dǎo)的細(xì)胞活動(dòng)，Beclin 1突然升高造成的失衡會(huì)加速細(xì)胞死亡[29]。譚成富等[30]發(fā)現(xiàn)，針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可降低Beclin 1的表達(dá)，調(diào)節(jié)再灌注時(shí)期的細(xì)胞自噬活動(dòng)，平衡其與凋亡間的反饋?zhàn)饔?，達(dá)到心肌保護(hù)作用。

6 誘導(dǎo)保護(hù)性蛋白增加

熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是細(xì)胞在接收應(yīng)激刺激后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種保護(hù)蛋白。再灌注時(shí)期，HSP可從穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)、干擾應(yīng)激所啟動(dòng)的細(xì)胞調(diào)亡程序、減輕細(xì)胞離子紊亂等方面穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，維持細(xì)胞功能，避免MIRI的發(fā)生[31]。譚成富等[32]觀察針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對(duì)HSP家族中最主要的三類蛋白：HSP90、HSP70、HSP27的影響，發(fā)現(xiàn)HSP70在針刺后即刻便出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)，并于針刺后48 h內(nèi)處于高表達(dá)狀態(tài)；HSP27的變化較晚，在針后24～48 h內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)；而HSP90受針刺影響較小，在各時(shí)間段其含量無(wú)明顯變化。HSP含量的變化說(shuō)明針刺對(duì)MIRI的保護(hù)效應(yīng)具有時(shí)間差異，并具有延遲相保護(hù)作用。

7 維護(hù)心肌細(xì)胞縫隙連接

縫隙連接(Gap junction,GJ)是細(xì)胞間進(jìn)行直接信息交流的細(xì)胞內(nèi)通道，可迅速將細(xì)胞內(nèi)的信息通過(guò)電信號(hào)或化學(xué)遞質(zhì)傳遞給相鄰細(xì)胞?？p隙連接蛋白(Connexin,Cx)是GJ通道的基本結(jié)構(gòu)和功能蛋白，在心室肌細(xì)胞內(nèi)Cx主要由Cx43構(gòu)成。周丹等[33]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注時(shí)GJ分布稀疏、扭曲，Cx43表達(dá)下降。電針預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴后GJ結(jié)構(gòu)完整性得到保護(hù)，Cx43表達(dá)量提升。說(shuō)明針刺內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理通過(guò)參提升心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)，參與缺血再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)。Cx43有兩種不同的狀態(tài)，即磷酸化和去磷酸化，Cx43只有在磷酸化狀態(tài)下才具有功能活性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心肌缺血會(huì)引發(fā)Cx去磷酸化且Cx43總量不變[34]，這種磷酸化的改變會(huì)減弱細(xì)胞間的耦合，引起嚴(yán)重的心律失常[35]。Gao等[36]研究發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)預(yù)處理可顯著減少去磷酸化的Cx43的含量，從而改善受損的GJ,減少再灌注期間心律失常的發(fā)生。

8 調(diào)控細(xì)胞色素P450代謝通路

花生四烯酸細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)是體內(nèi)參與多種內(nèi)源性和外源性化合物代謝的一系列酶系，可代謝花生四烯酸?；ㄉ南┧?Arachidonic acid,AA)經(jīng)CYP450代謝途徑可產(chǎn)生環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)及20-羥-二十烷四烯酸(20-HETE)。EETs具有強(qiáng)大的心血管效應(yīng)，具有抗炎、擴(kuò)血管、溶纖、抗凋亡和促血管生成作用[37-38]而20-HETE在再灌注期間會(huì)造成心肌組織蛋白過(guò)氧化損傷，加重MIRI[39]。代謝花生四烯酸產(chǎn)生EET的CYP亞家族以CYP2C和CYP2J為主[40]，生成HETEs的主要是CYP4家族，主要是CYP4A和CYP4F。李洋等[41]運(yùn)用基因芯片技術(shù)分析內(nèi)關(guān)穴調(diào)節(jié)MIRI作用的潛在通路和靶基因。結(jié)果表明電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可上調(diào)CYP2家族基因，促進(jìn)EETs生成同時(shí)下調(diào)CYP1和CYP4家族基因，抑制內(nèi)源性20-HETE生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝減輕MIRI。

9 討論

內(nèi)關(guān)善治心胸諸疾，早在《靈樞·經(jīng)脈》篇中提到：“心系實(shí)則心痛，虛則為頭強(qiáng)，取之兩筋間也?！焙笫烙小栋侔Y賦》“建里內(nèi)關(guān)，掃盡胸中之苦悶”和《標(biāo)幽賦》“胸腹?jié)M痛刺內(nèi)關(guān)”的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。中醫(yī)“治未病”思想倡導(dǎo)“未病先防，既病防變”，內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌的保護(hù)作用在心肌缺血再灌注損傷的防治中有很大的應(yīng)用前景，實(shí)驗(yàn)證實(shí)在心肌組織發(fā)生病理改變前針刺內(nèi)關(guān)穴即可減少缺血再灌注對(duì)心肌組織的損害，臨床中，可以采用這種簡(jiǎn)單的干預(yù)手段，在缺血期及溶栓治療前針刺內(nèi)關(guān)穴以心肌起到良性保護(hù)作用。目前其作用機(jī)制研究雖深入到分子生物學(xué)水平，但多為研究單一蛋白或基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞信號(hào)途徑或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響，尚未形成完整的理論體系，對(duì)作用主次及先后還缺乏細(xì)致的研究。隨著基因芯片技術(shù)的應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)同一時(shí)間對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因進(jìn)行大規(guī)模平行檢測(cè)與分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)關(guān)穴調(diào)節(jié)作用進(jìn)行多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)分析，在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究中有廣泛的應(yīng)用前景，其作用機(jī)制的清晰和完善將為其在重大疾病的應(yīng)用提供更完善的理論支持和新的治療思路。