王巖青 余功富

(浙江省臺州市路橋區(qū)城區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 318050)

畜禽的病毒病是獸醫(yī)臨床上最常見的疾病之一[1]，具有傳播速度快、死亡率高和易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)[2-3]，對畜牧業(yè)生產(chǎn)的影響較大[4]。畜禽抗病毒藥物指在畜牧養(yǎng)殖上用于禽流感預(yù)防和早期治療及豬傳染性胃腸炎防治的一類藥物[5]。在我國，抗病毒藥物曾被報道用于獸醫(yī)臨床治療病毒感染。農(nóng)業(yè)部禁止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用金剛烷胺等抗病毒藥物[6]，美國FDA同樣禁止金剛烷類和神經(jīng)氨酸酶抑制劑類抗流感病毒藥物用于禽類[7]。

目前，抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的非法使用屢禁不止，不法分子在獸藥、飼料和動物保健品中添加抗病毒類化藥。因此，對畜禽用抗病毒藥物檢測技術(shù)進(jìn)行綜述，為有效監(jiān)測抗病毒藥物提供參考，把畜禽產(chǎn)品中抗病毒類化藥殘留風(fēng)險降到最低，保障畜牧業(yè)健康有序發(fā)展。

1 抗病毒藥物殘留檢測

1.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (HPLC-MS/MS)

HPLC-MS/MS具有定性準(zhǔn)確的優(yōu)異性能，是近年來獸藥殘留檢測研究的主要方向[9]。已有抗病毒藥物殘留的檢測方法主要針對雞肉[8]、雞蛋[9]、豬肉[10]、肝臟[11]、腎臟[12]等可食性組織和畜禽糞便[13]等，檢測藥物主要是金剛烷胺、利巴韋林[14]、嗎啉胍及同類其他藥物[15]。

因抗病毒藥物大都含有氨基，屬于有機(jī)堿，在酸性溶液中易溶于水，在堿性溶液中易溶于有機(jī)溶劑，樣品前處理主要采用三氯乙酸、三氯乙酸+乙腈、三氯乙酸+甲醇、甲醇、乙腈等溶劑提取。該類藥物在提取液中主要以陽離子形式存在，提取后大多采用混合型陽離子交換柱 (MCX)、強(qiáng)陽離子交換柱(SCX)或親水親脂型離子交換柱 (HLB)固相萃取柱凈化。利巴韋林同時含有氨基和醇羥基，極性強(qiáng)，常見的固相萃取柱凈化效果不理想，采用苯硼酸型 (PBA)固相萃取柱凈化效果較好[16]。抗病毒藥物在進(jìn)行液相色譜分離時除少數(shù)使用C18色譜柱，多數(shù)使用親水性較強(qiáng)的Xamide、HILIC、ZIC-HILIC等色譜柱，以甲醇或乙腈+甲酸或乙酸銨水溶液為流動相，采用梯度洗脫為主要方式分離[17]。采用電噴霧正離子源和多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行采集為主，以滿足確證的要求。采用通用QuEChERS法[18]進(jìn)行前處理，只能去除少部分雜質(zhì)。張鑫等將藥物分別保留在強(qiáng)陽離子交換柱和石墨化碳柱上，并通過洗脫液置換，實(shí)現(xiàn)了同時檢測8種抗病毒藥物的方法，操作簡便，檢測限低，實(shí)用性和創(chuàng)新性較強(qiáng)[19]。

1.2 超高效液相-飛行時間質(zhì)譜 (UPLC-Q-TOF)法

UPLC-Q-TOF能在寬質(zhì)量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)高分辨，得到化合物的準(zhǔn)確分子量，進(jìn)而得到未知物質(zhì)的可能分子式等突出特點(diǎn)[20]，被廣泛應(yīng)用于藥物分析等領(lǐng)域[21]。鄒宇等利用該技術(shù)測定雞肉組織中的金剛烷胺[22]。樣品用1%三氯乙酸溶液-乙腈(1∶1)溶液超聲提取，經(jīng)固相萃取柱凈化濃縮，用Acquity UPLC BEH C18柱分離，以乙腈和0.1%甲酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子模式將樣品離子化，TOF MS/MS模式進(jìn)行檢測，提取m/z135.12的碎片離子進(jìn)行監(jiān)測，以色譜保留時間和質(zhì)譜碎片離子豐度比定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果金剛烷胺在5.91～147.75ng/ml。濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，檢出限 (LOD)為 4.9ng/g，定量限 (LOQ)為 9.8ng/g。回收率在81.8%～96.3%，精密度＜6.4%。

1.3 在線凈化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (TurboFlow)法

TurboFlow結(jié)合了擴(kuò)散、化學(xué)和體積排除的原理，在捕獲分析物的同時快速凈化樣品，與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，在簡化樣品前處理的同時保證了方法的靈敏度。艾連峰等研究該技術(shù)[23]。樣品用甲醇-1%三氯乙酸或乙腈提取，提取液用陽離子交換在線凈化柱 (Cyclone MCX)凈化，5%氨水-甲醇溶液將分析物洗脫轉(zhuǎn)入至Capcell Pak MG C18分析柱，經(jīng)色譜分離后，用串聯(lián)質(zhì)譜檢測。方法的定量限 (LOQ)牛奶為0.25μg/kg，動物組織和雞蛋為0.5μg/kg，在0.1～20μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)大于0.9995。方法在3個水平的添加回收率為83.3%～93.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.5%～5.9%。

2 獸藥和飼料中抗病毒藥物的檢測

獸藥和飼料中添加抗病毒藥物給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了安全隱患和損失。為了規(guī)范獸藥和飼料市場，農(nóng)業(yè)部不斷加大對獸藥和飼料處方外非法添加的打擊力度。目前用于獸藥和飼料中添加抗病毒藥物的檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜法等。

2.1 獸藥中添加抗病毒藥物的檢測

高效液相色譜配二極管陣列檢測器（HPLC-PDA）是獸藥中抗病毒藥物確證和定量的重要手段。陳晨等建立了柴胡注射液中利巴韋林的檢測方法[24]。郝利華等建立了黃芪多糖注射液中利巴韋林的HPLC-PDA方法[25]。李樹綱等建立了高效液相色譜法檢測白龍散、黃連解毒散、蒼術(shù)香連散等7種獸用中藥散劑中利巴韋林的方法[26]。

LC-MS對添加物的檢測無歧視，能彌補(bǔ)HPLC方法中紫外檢測器的不足，并且合適的質(zhì)譜條件下可以獲得添加物的分子離子和碎片信息，對于推斷未知添加物尤為重要。因此，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在獸藥制劑中非法添加物的篩查與檢測方面的應(yīng)用也日益增多。高迎春等建立了檢測氟喹諾酮類藥物可溶性粉中利巴韋林的UP LC-MS/MS方法[27]?；ㄥ\等建立了獸藥制劑中違禁藥物金剛烷胺的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[28]。劉雪紅等應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了獸用中藥制劑清瘟敗毒散中金剛烷胺的檢測方法[29]。魏秀麗等建立了多種抗菌藥物中非法添加利巴韋林檢測的UPLC-MS/MS方法[30]。

2.2 飼料中添加抗病毒藥物的檢測

目前，飼料中抗病毒藥物檢測以氣相色譜和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為主。

張立華等采用石英毛細(xì)管柱DB-5Ms、程序升溫、FID檢測器檢測，建立了中獸藥散劑中金剛烷胺的氫火焰離子化氣相色譜檢測方法[31]。

周曉等建立了飼料中金剛烷胺的檢測方法[32]。試樣用甲醇-1%三氯乙酸提取，混合型陽離子交換小柱（MCX）凈化，上機(jī)測定。流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液，采用電噴霧離子源正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行測定和確證，以外標(biāo)法定量。吳劍平等建立了預(yù)混合飼料中7種抗病毒藥物含量的檢測方法，檢測的藥物為金剛烷胺、嗎啉胍、金剛乙胺、阿昔洛韋、利巴韋林、更昔洛韋和奧司他韋[33]。用乙腈提取，無水硫酸鎂脫水和鹽析，C18粉和丙基乙二胺凈化。使用親水作用色譜柱分離，流動相為0.2%甲酸和乙腈，采用梯度洗脫，三重四級桿質(zhì)譜進(jìn)行定性定量分析。

3 小結(jié)

畜禽抗病毒藥物殘留檢測以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高分辨-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)為發(fā)展趨勢[34-35]。常量檢測主要采用HPLC-PDA法檢測獸藥和飼料中的抗病毒藥物。HPLC-PDA法用于有紫外吸收的藥物檢測，方便快捷，對于藥物本身沒有紫外吸收或有紫外吸收但組成成分復(fù)雜的藥物不能使用，這需要借助聯(lián)用技術(shù)。相信會有越來越多新穎的技術(shù)和先進(jìn)的儀器設(shè)備致力于解決畜禽組織基質(zhì)成分復(fù)雜、獸藥種類多等難點(diǎn)問題，增強(qiáng)檢測技術(shù)的實(shí)用性，使其能廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的日常檢測，為畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康提供保障。