翟乃祥 任秀智 魯艷芹 韓金祥*

1. 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250062 2. 濟(jì)南大學(xué)-山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200 3. 天津市武清區(qū)人民醫(yī)院，天津 301700

遺傳性骨病是臨床上表現(xiàn)出具有較強(qiáng)遺傳異質(zhì)性的骨、軟骨發(fā)育不良的疾病，以骨骼塑形、生長、分化、內(nèi)部穩(wěn)態(tài)等異常為特征，多為發(fā)病率較低的罕見病，遺傳性骨病患者是龐大的群體。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在疾病調(diào)控中的作用，本文就circRNAs對骨相關(guān)影響的研究進(jìn)行總結(jié)。

1 CircRNA及其特點(diǎn)

1.1 CircRNA分類

CircRNA是一類特殊的非編碼RNA(Noncoding RNA)它的特殊性在于它并不是傳統(tǒng)的5‘到3’的線性結(jié)構(gòu)，而是長度在幾百個堿基以上的閉合的環(huán)型結(jié)構(gòu)[1]。在馬鈴薯中的RNA病毒、酵母菌[2]中發(fā)現(xiàn)circRNAs的時候認(rèn)為它們是無意義的編碼副產(chǎn)物[3]，但從小鼠精子決定基因中發(fā)現(xiàn)circRNAs可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后[4]，對circRNAs的研究便開始了新的時代，circRNAs的研究逐漸深入，其功能、特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)、形成方式等開始為人們所知。

根據(jù)形成方式的不同，內(nèi)源性circRNAs可分為內(nèi)含子circRNAs、外顯子circRNAs和外顯子-內(nèi)含子circRNAs[5]。

1.1.1內(nèi)含子形成的circRNA:內(nèi)含子形成的circRNA通常是RNA 聚合酶將內(nèi)含子從mRNA前體上剪切下來，內(nèi)含子首尾相接成環(huán)形，這種circRNAs被稱為環(huán)狀內(nèi)含子RNA(ciRNA)。ciRNAs主要存在于人類細(xì)胞。它的合成需要一個重要的位點(diǎn):包含一個接近5′端，長度為7 nt 富含堿基G、U的拼接位點(diǎn)和RNA剪切分支位點(diǎn)附近11個nt的堿基C富集區(qū)域[6]。

1.1.2外顯子形成的circRNA：外顯子circRNA是目前研究最多的circRNAs，它們中一部分衍生自編碼RNA的5‘或3’非翻譯區(qū)(5‘UTR或3’UTR)，其他來自非編碼RNA[7-8]。外顯子circRNAs的形成有兩種假說，第一種假說認(rèn)為前體RNA在轉(zhuǎn)錄時越過了一段外顯子，之后剪切酶在這段被越過的外顯子兩端進(jìn)行切割，切割后的兩端相連形成閉合的鎖套結(jié)構(gòu)(lariat)[9]。通過剪接會產(chǎn)生多種circRNAs: circRNAs可通過背接法(Back-Splicing)從單一的外顯子衍生出來，也可由多個外顯子經(jīng)外拼接形成circRNAs。另一種假說認(rèn)為RNA轉(zhuǎn)錄時外顯子兩端的內(nèi)含子發(fā)生了堿基配對，由下游的外顯子3′端尾巴連接到上游外顯子5′端頭部，下游3′剪接體結(jié)合上游5′剪接受體，使兩個內(nèi)含子結(jié)合，而環(huán)化的外顯子被釋放成為了circRNAs[10]。

1.1.3外顯子和內(nèi)含子片段組成的circRNA：許多細(xì)胞核內(nèi)的circRNAs包含未剪接的內(nèi)含子，這些circRNAs被稱為外顯子-內(nèi)含子circRNAs(EIciRNA)[11]。EIciRNA大量存在于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，如果去除EIciRNA則會降低親本mRNA的表達(dá)，表明這些circRNAs可以促進(jìn)親本mRNA轉(zhuǎn)錄[12]。如EIciRNA可以與U1snRNP(U1核內(nèi)核糖核蛋白)結(jié)合促進(jìn)RNA 聚合酶 II與啟動子相互作用從而增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄[13]。

1.2 CircRNA特點(diǎn)

CircRNA具有穩(wěn)定性高、分布廣、進(jìn)化相對保守、表達(dá)的時序性與特異性等特點(diǎn)。CircRNA不同于一般的線性RNA，是不含有poly A尾巴的5′、3′端閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沒有核酸外切酶的切割位點(diǎn)，因而不易被酶切降解，這種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性使其在面對環(huán)境變化時對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。CircRNA在真核、原核生物[14]、類病毒、病毒、以及古生菌[15]中廣泛存在。與其線性異構(gòu)體[16]相比，circRNA的表達(dá)水平會高出10倍甚至更多。大部分circRNA存在于真核生物的細(xì)胞漿中，少數(shù)位于細(xì)胞核內(nèi)[17]。CircRNA在進(jìn)化上相對保守[18]，在不同物種中往往存在較多相似序列，從人腦中檢出的circRNAs在小鼠、果蠅中都有相似序列，比如在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的1 903個circRNA有81個在人類體內(nèi)也存在相同的拷貝。比較豬、人和小鼠的circRNA序列發(fā)現(xiàn)20.20%的豬circRNAs具有人類直系同源物，而16.96%的豬circRNAs具有小鼠直系同源物。豬的circRNAs有29.4%在人體內(nèi)有直系同源外顯子[19]。在小鼠和人體內(nèi)分別有1,510個circRNAs(25.45%)和5,189個circRNAs(87.44%)與家豬circRNAs有直系同源物。

CircRNAs在動物不同時期、不同組織的表達(dá)水平不同，具有發(fā)育階段和組織特異性:在果蠅大腦中，有些circRNAs會隨著年齡而增多。在線蟲體內(nèi)的上千種circRNAs中，不同時期的circRNAs表達(dá)數(shù)目和具體種類不同。血液中circRNAs的表達(dá)量高于肝臟和小腦，大部分血漿中的circRNAs存在于有膜脂包被的結(jié)構(gòu)[20]，如外泌體和微小囊泡[21]。

2 CircRNA生物學(xué)功能

2.1 MiRNA分子海綿

許多circRNAs上有miRNAs結(jié)合位點(diǎn)，使其成為競爭性內(nèi)源RNA，可以與miRNAs結(jié)合從而將miRNAs隔離。例如：miR-652-3p可以以結(jié)合編碼基因的方式發(fā)揮作用調(diào)節(jié)線粒體功能，miR-652-3p靶向作用于MTP18，與其3'UTR序列互補(bǔ)結(jié)合。沉默其表達(dá)，對線粒體增殖和凋亡起到調(diào)控作用。而circRNA-MFACR通過結(jié)合miR-652-3p，促進(jìn)MTP18mRNA翻譯表達(dá)，調(diào)控心肌細(xì)胞中線粒體分裂和凋亡。即circRNA可以作為內(nèi)源性“miRNA分子海綿”與miRNAs吸附在一起，使其喪失正常功能。“miRNA分子海綿”抑制miRNAs與靶基因結(jié)合的功能可以在不同基因組中表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞miRNAs豐富度，是miRNAs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的主要組分[22]。

2.2 編碼蛋白/多肽功能

與傳統(tǒng)認(rèn)識的非編碼RNA不同，部分circRNAs具有蛋白質(zhì)或多肽編碼功能， circ-ZNF609能夠編碼肌肉分化相關(guān)蛋白，該circRNAs從其宿主基因的第二外顯子成環(huán)處生成，帶有一個753nt的開放閱讀框架(ORF)，它的UTR元件能驅(qū)動不依靠5'端帽子，而依靠IRES序列的順式調(diào)控原件從circRNAs的中部啟動并進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，但這種翻譯速度要低于帽子端起始的正常翻譯[23]。還有circRNAs可以在m6A甲基化修飾后驅(qū)動非帽子依賴性的翻譯。與IRES序列相似，m6A甲基化區(qū)也能驅(qū)動circRNAs翻譯，它可以識別YTHDF3蛋白，結(jié)合到circRNAs的修飾位點(diǎn)并吸引eIF4G2蛋白和其他翻譯起始因子來驅(qū)動circRNAs的翻譯[24]。m6A修飾的circRNAs還有高度的細(xì)胞特異性，即使是相同的circRNAs分子在不同的細(xì)胞中m6A修飾的狀態(tài)也不盡相同。m6A一般傾向修飾大片段外顯子circRNA。有一些circRNAs會與核糖體結(jié)合形成Ribo-circRNA復(fù)合物來影響編碼，它們的UTR區(qū)有類似IRES的翻譯驅(qū)動功能，但翻譯效率較低[25]。CircRNAs的蛋白翻譯功能的影響意義是巨大的，如circ-FBXW7可直接翻譯蛋白FBXW7-185aa，與其母基因編碼的FBXW7蛋白協(xié)同調(diào)控c-Myc的穩(wěn)定性，抑制惡性膠質(zhì)瘤的生長[26]。這種發(fā)現(xiàn)為circRNAs并非一般的非編碼RNA提供了證據(jù)。

2.3 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表達(dá)

CircRNAs可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，或通過影響RNA剪接而與蛋白質(zhì)發(fā)生關(guān)聯(lián)，間接影響蛋白質(zhì)的功能，起到調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或剪接的作用。外源性circRNAs通過內(nèi)部的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或通過滾環(huán)擴(kuò)增機(jī)制在體內(nèi)或體外進(jìn)行翻譯[27]。植物體內(nèi)circRNAs能在轉(zhuǎn)錄中參與R-Loop結(jié)構(gòu)形成，拖慢轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行來影響RNA與RNA和DNA與RNA相互作用來實現(xiàn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)可變剪切的產(chǎn)生。在基因表達(dá)方面，circRNAs發(fā)揮類似mRNA的作用，通過與翻譯起始位點(diǎn)結(jié)合或破壞成熟的線性RNA的完整性使線性轉(zhuǎn)錄物不翻譯，EiciRNAs與RNA 聚合酶相互作用后與小核糖核蛋白結(jié)合，進(jìn)而激活親代基因的轉(zhuǎn)錄，抑制RNA-蛋白質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)miRNAs的活性[28]。

2.4 CircRNA生物標(biāo)志物與信號通路調(diào)節(jié)

細(xì)胞內(nèi)的circRNAs會被分泌到細(xì)胞外泌體，由于circRNAs穩(wěn)定且不易降解的特性，它在外泌體和血漿中的存在相當(dāng)穩(wěn)定且廣泛。這為其作為疾病標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。血液中的總circRNAs表達(dá)水平與神經(jīng)組織十分相似，如：circRNA cdr1在阿爾茨海默病人血液中特異性表達(dá)[29]，與正常人相比直腸癌患者血液中就多出257種新circRNAs。而且與正常血清相比，這些癌癥血清中circRNA-KLDHC10的表達(dá)水平明顯升高[30]。MHCC-LM3型肝癌細(xì)胞中circRNAs與線性RNA的比例是普通細(xì)胞中的7倍[30]?？梢哉f外泌體和血漿中穩(wěn)定存在的circRNAs為診斷某些癌癥提供了便利途徑，circRNAs可作為一種可靠的疾病標(biāo)志物發(fā)揮功能。

由于circRNAs不易被核酸酶降解的特性，可以在體外通過核酸酶處理去除線性RNA，得到高純度的外源circRNAs之后用外源circRNAs轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的自身免疫效應(yīng)通路被激活，起到抑制病毒感染的作用，表明外源circRNAs在機(jī)體免疫等信號通路調(diào)節(jié)可能存在重要作用[31]。

3 CircRNA與骨相關(guān)疾病

3.1 CircRNA與骨關(guān)節(jié)疾病

關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)是一種由于軟骨降解，骨質(zhì)增厚，骨刺形成而引起的退行性關(guān)節(jié)病[32]。研究者通過circRNAs芯片對OA病人和正常人進(jìn)行circRNAs差異表達(dá)篩選和ceRNAs網(wǎng)絡(luò)共表達(dá)分析，在關(guān)節(jié)炎與正常軟骨中，有71種circRNA、表達(dá)存在差異，circRNA_100876(circRNA-CER)、circRNA_100086、circRNA_101178和circRNA_101914等16個circRNA表達(dá)上調(diào)，另外55個表達(dá)下調(diào)，它們在軟骨損傷和關(guān)節(jié)炎病情發(fā)展中可能有重要作用。其中，circRNA-CER可以被細(xì)胞白介素1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNFa)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，它通過內(nèi)源性競爭miR-136來調(diào)控MMP13的表達(dá)，參與軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)損傷過程。TNFa可以促進(jìn)miR-193b的表達(dá)，miR-293b可以抑制早期軟骨形成，而它調(diào)節(jié)早期軟骨形成的靶基因IGF1R又可以被circRNA_0045714促進(jìn)表達(dá)，由于基因IGF1R在早期軟骨形成中的重要作用，circRNA_0045714在與關(guān)節(jié)炎疾病中也可能存在重要作用[33]。

3.2 CircRNA與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，成骨細(xì)胞的分化由一系列激素、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[16]，其中轉(zhuǎn)錄因子中的骨形成蛋白2(BMP2)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族，是人體重要的細(xì)胞因子之一，也是異位骨和軟骨形成的誘導(dǎo)劑[32]，在胚胎成長、細(xì)胞生長和分化及骨骼發(fā)育和骨折修復(fù)中起重要作用。經(jīng)過BMP2處理的MC3T3-E1細(xì)胞中有158個circRNAs與正常細(xì)胞相比有表達(dá)差異，其中74種circRNAs上調(diào)，84種circRNA下調(diào)。通過qRT-PCR檢驗了4種circRNAs的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過BMP2處理后，細(xì)胞中circRNA5846，circRNA19142和circRNA10042都顯著上調(diào)。CircRNA5846和circRNA19 142分別與51種和21種miRNA有相互作用, 它們均與MiR-7067-5p作用行使miRNA海綿功能，且與FGF，EGF，PDGF和Wnt信號通路相關(guān)，可以參與細(xì)胞生長和分化[34]。BMP2可通過circ19142 / circ5846靶向miRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)成骨分化[34]。經(jīng)BMP2處理組成骨分化相關(guān)因子ALP、SP7和RUNX2的mRNA表達(dá)水平顯著增加。另外，CircRNA19142與miR-222-3p和miR-7067-5p相互作用[35]，而miR-222-3p能作為破骨細(xì)胞發(fā)生的抑制劑[26]。CircRNAs在小鼠破骨細(xì)胞生長的不同階段也是不同的，在檢測的1 797種circRNAs中，147種circRNA在前破骨細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，109種表達(dá)下調(diào)；在成熟破骨細(xì)胞中，78種circRNA表達(dá)上調(diào)；在活化的破骨細(xì)胞中，111種circRNA和94種miRNAs表達(dá)上調(diào)[36]。

3.3 circRNA與其它非編碼RNA與靶基因的作用

CircRNA-miRNA協(xié)同調(diào)節(jié)在破骨細(xì)胞形成過程中發(fā)揮重要作用。在協(xié)同調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的miR-103受circRNA007873的上調(diào)和circRNA010763、circRNA015622的下調(diào)。Wnt1在骨、軟骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用，Wnt1是XV型(osteogenesis imperfect，OI)常染色體隱性遺傳成骨不全的致病基因。目前已知的靶向Wnt1的miRNAs包括let-7e、miR-21、miR-34 a、miR-122、miR-148 a、miR-148b與miR-152等7種。針對以上miRNAs分析中與之相互作用的circRNAs、靶基因的生物信息學(xué)研究表明，這些miRNAs及其靶基因聚集在Focal adhesion、MAPK、Notch與TGF-beta信號通路， MAPK信號通路中發(fā)現(xiàn)DUSP1與MRPS35_hsa_circ_001042 均分別是與miR-21、miR-148 a、miR-148b及miR-152等4種miRNAs相互作用的靶基因與circRNA。ARHGAP35_hsa_circ_001101、KIAA0922_hsa_circ_001421與 PARP16_hsa_circ_000601與miR-34 a、miR-148 a、miR-148b和miR-1524等4種microRNAs分子相互作用，可能發(fā)揮分子海綿功能(Ref73)[37]。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，circRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，功能復(fù)雜，來源多樣，分布廣泛，未來關(guān)于其蛋白編碼功能以及“miRNA分子海綿”功能仍有待進(jìn)一步研究，目前對于circRNA與骨相關(guān)疾病的研究成果較少，但miRNAs與骨病已經(jīng)有大量經(jīng)過驗證的功能，例如與成骨細(xì)胞相關(guān)的miR-222-3p和miR-7067-5p會被circRNA5846和circRNA19142調(diào)控。鑒于circRNAs與miRNAs之間可能存在的豐富的相互作用，circRNAs很可能通過與miRNAs的相互作用或是自身的編碼能力對遺傳性骨病產(chǎn)生影響。故對circRNAs的研究對骨相關(guān)病的成因以及基因?qū)用娴闹委煻家饬x重大。