謝麗華 陳娟 謝冰穎 許惠娟 陳賽楠 葉云金 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥研究院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點研究室，福建 福州 350003

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是常見的老年性疾病，發(fā)病率高。中醫(yī)藥能顯著改善骨質(zhì)疏松癥癥狀、防治并發(fā)癥、提高生存質(zhì)量和延長壽命等。但是中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)其基本理論及原理的闡述，對現(xiàn)代疾病生物學(xué)本質(zhì)的探索不足，如能在生物學(xué)層面運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對中醫(yī)證候的實質(zhì)進(jìn)行深入的闡述，這將更有利于中西醫(yī)的溝通與結(jié)合。表觀遺傳學(xué)是當(dāng)前研究的一個熱點，它能很好地闡述“遺傳-環(huán)境-疾病”相互作用機(jī)制和關(guān)系，而這種“環(huán)境疾病”模式與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中“天人合一”的整體觀相符。所以將表觀遺傳學(xué)的概念及相關(guān)技術(shù)引入到中醫(yī)基礎(chǔ)理論的研究會有所突破，并有新發(fā)現(xiàn)的可能。

miRNA作為表觀遺傳學(xué)主要研究的內(nèi)容之一，主要作用環(huán)節(jié)在基因轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控。miRNA是一類存在于真核生物體內(nèi)，長22～25 bp的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，通過與靶基因的特異性堿基配對引起靶序列降解或翻譯阻遏，從而對靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[1-3]。研究表明miRNA參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育等多種生物學(xué)過程[4]。課題組前期已經(jīng)多次應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)開展證候-基因組研究，發(fā)現(xiàn)腎陰虛證主要集中于代謝、免疫功能類基因的表達(dá)異常[5-7]。在此系列研究的基礎(chǔ)上，本實驗選擇為基因調(diào)控環(huán)節(jié)的miRNA，計劃在沿用病癥結(jié)合的研究思路基礎(chǔ)上，采用miRNA芯片，觀察PMOP腎陰虛證的miRNA表達(dá)變化情況，旨在為闡明PMOP腎陰虛證的本質(zhì)及為治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用病例對照研究方法，選擇絕經(jīng)后2年以上、75歲以下的受試者，對受試者進(jìn)行問卷調(diào)查，檢測肝腎功能、血尿常規(guī)、心電圖和B超等。雙能X線骨密度儀檢測正位腰椎L1～4和左側(cè)股骨上端骨密度，中醫(yī)辨證，分組如下：PMOP腎陰虛組3例，PMOP腎陽虛組3例，健康絕經(jīng)后婦女3名作為對照組。本研究方案獲得福建省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)藥臨床研究倫理委員會審批通過。(1)診斷標(biāo)準(zhǔn)：骨質(zhì)疏松癥診斷參照《中國人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)》(第2稿)[8]，中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》[9]。(2)納入標(biāo)準(zhǔn)：符合骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；符合中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；年齡在46～75歲，自然絕經(jīng)2年以上的漢族婦女；受試者知情同意。(3)排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合骨質(zhì)疏松癥診斷及中醫(yī)腎陰虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)者；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥者；合并有心腦血管嚴(yán)重疾病者；肝、腎功能檢查異常者；最近一個月用過中藥治療骨質(zhì)疏松癥者，或近3個月內(nèi)用激素替代治療、使用降鈣素者，或近6個月內(nèi)有連續(xù)15 d用雙膦酸鹽等防治骨質(zhì)疏松癥者。

1.2 用miRNA芯片技術(shù)檢測miRNA表達(dá)譜及篩選差異表達(dá)基因

1.2.1樣品RNA提取和質(zhì)檢：取外周血5 mL，淋巴細(xì)胞分離液提取靜脈血中的單個核細(xì)胞，使用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，Nanodrop測定RNA 260/280的吸光度及濃度，用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。

1.2.2芯片雜交及掃描：基因芯片使用Agilent miRNA芯片，委托北京博奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。對Total RNA進(jìn)行純化，純化后重新定量。Total RNA 的去磷酸化、標(biāo)記、雜交，在洗液中清洗甩干后，使用 Agilent 芯片掃描儀對芯片進(jìn)行掃描，得到雜交圖片。

1.2.3圖像采集和數(shù)據(jù)分析：使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)，然后使用Agilent Gene Spring軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析?；跀?shù)據(jù)庫KEGG查詢差異涉及miRNA的信號通路，及相關(guān)靶基因數(shù)據(jù)庫分析序列以及預(yù)測靶基因。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者數(shù)量分析

納入對象9人均進(jìn)入結(jié)果分析，無中途退出者。

2.2 PMOP腎陰虛證組與其他2組miRNA表達(dá)譜的差異性分析

PMOP腎陰虛證組與對照組相比，篩選差異表達(dá)miRNA49條；PMOP腎陰虛證組與PMOP腎陽虛證組相比，篩選差異表達(dá)miRNA71條；PMOP腎陰虛證組分別與其他2組比較，有20條共同的差異表達(dá)miRNA，與正常對照組相比，其中表達(dá)上調(diào)的miRNA有17條，表達(dá)下調(diào)的miRNA有3條(見表1)。

表1 PMOP腎陰虛證組與其他2組比較共同差異表達(dá)miRNATable 1 Differential expression of miRNA in Kidney Yin deficiency group compared with the other two groups

2.3 實時熒光定量PCR驗證芯片結(jié)果

根據(jù)miRNA表達(dá)譜芯片檢測的結(jié)果，隨機(jī)選取3個表達(dá)變化顯著的miRNA (hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p)用實時熒光定量PCR再次驗證，內(nèi)參選擇snRNAU6。結(jié)果顯示(圖1)，與對照組相比，PMOP腎陰虛組hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p表達(dá)水平明顯升高(FC=3.56、4.20)，hsa-miR-95-3p表達(dá)明顯下調(diào)(FC=2.10)，3條miRNA在芯片樣本中得到較好的驗證，qPCR的結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)趨勢一致。

圖1 定量PCR驗證基因芯片的結(jié)果Fig.1 Confirmation of microarray results using quantitative PCR

2.4 差異表達(dá)miRNA的pathway分析

將差異表達(dá)的miRNA用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行pathway分析，選取前30個顯著富集的kegg通路，根據(jù)P值繪制成柱狀圖(圖2)，主要包括代謝通路、癌癥通路、Rap1信號通路、粘著斑信號通路、PI3K-Akt、MAPK信號通路、鈣離子信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號通路、Ras信號通路、Wnt信號通路。

2.5 差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測

為了更全面地了解PMOP腎陰虛證相關(guān)miRNA的功能，同時采用miRWalk、Microt4、miRanda、miRdb、miRMap、PicTar2、PITA、RNA22、Targetscan、RNAhybrid 10個數(shù)據(jù)庫逐一預(yù)測這20個miRNA的靶基因，進(jìn)行綜合統(tǒng)計分析，最終結(jié)果取6個數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的重疊部分，為了進(jìn)一步縮小靶基因預(yù)測范圍，從結(jié)果中挑選出同時被5個miRNA同時作用的靶基因，共9個(見表2)。

3 討論

隨著對miRNA功能研究的深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。miRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種作用。許多miRNA被證明在骨代謝中都起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用，參與維持骨代謝的平衡。例如miR-133 a和miR-204通過抑制成骨分化中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，抑制成骨細(xì)胞分化[10-11]；有些miRNA在骨重建過程中有雙重作用，如miR-214既能促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，同時也能抑制骨形成[12-13]。對這些miRNA的深入研究可以為骨代謝的疾病診斷與治療提供新的思路與方法。本研究以miRNA芯片技術(shù)為研究手段，通過探討PMOP腎陰虛證組與PMOP腎陽虛證組和健康絕經(jīng)后婦女3組miRNA基因差異的表達(dá)情況，揭示與PMOP腎陰虛證相關(guān)的miRNA表達(dá)譜特征，旨在整體miRNA表達(dá)水平闡明POP腎陰虛證的本質(zhì)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎陰虛證組與對照組、腎陽虛證組的差異表達(dá)miRNA分別為49條、71條；腎陰虛證組與其他兩組比較，篩選出20條共同差異表達(dá)miRNA，和對照組相比，其中表達(dá)上調(diào)的有17條，表達(dá)下調(diào)的有3條。隨后挑選hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p這3條miRNAs進(jìn)行qPCR驗證，證實qPCR的表達(dá)數(shù)據(jù)與芯片數(shù)據(jù)趨勢一致。

圖2 顯著富集的kegg信號通路Fig.2 Significantly enriched kegg pathway

表2 差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測Table 2 Target gene prediction results of differential expression of miRNA

miRNA是機(jī)體中一個龐大復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系，對miRNA相關(guān)信號通路的研究是了解其調(diào)控機(jī)理的重要方式。筆者對這些差異miRNA進(jìn)行根據(jù)pathway分析，發(fā)現(xiàn)這些miRNA主要參與代謝通路、癌癥通路、Rap1信號通路、粘著斑信號通路、PI3K-Akt、MAPK信號通路、鈣離子信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號通路、Ras 信號通路、Wnt信號通路的調(diào)控等。研究證實，這些信號通路的多條通路都參與了骨代謝的調(diào)控。PI3K-Akt信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，能調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[14-15]，Akt及其下游的靶基因是骨形成的關(guān)鍵調(diào)控者。Wu等[16]研究證實四物湯的提取物可以通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路促進(jìn)骨形成進(jìn)而防止骨質(zhì)疏松。MAPK 信號通路主要包括 ERK1/2通路、JNK 通路、P38 通路和 ERK5通路。Kim等[17]的研究結(jié)果表明膠原蛋白水解物可以通過ERK/MAPK通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖； Hah等[18]實驗說明JNK 通路在成骨細(xì)胞分化和生存中具有重要作用；Choi等[19]和Rodríguez-Carballo等[20]報道了P38通路可以通過促進(jìn)骨形成和抑制破骨細(xì)胞分化改善骨質(zhì)疏松。Wnt信號通路對成骨細(xì)胞的分化和骨形成具有重要的促進(jìn)作用，它可以通過調(diào)節(jié)Runx2等成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[21]。此過程對于骨形成非常重要，當(dāng)該通路紊亂時會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。由于Wnt信號通路在成骨細(xì)胞中扮演著重要角色，已成為藥物設(shè)計的靶標(biāo)，并被成功地應(yīng)用于臨床。如Romosozumab藥物已經(jīng)完成臨床II期研究階段，目前正在進(jìn)行III期臨床項目。Romosozumab是一種全人源化單克隆抗體，通過抑制骨硬化蛋白活性，激活Wnt通路而促進(jìn)骨形成，從而促進(jìn)成骨作用[22-23]。總之，骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種相關(guān)信號通路之間存在交互和交叉的作用，具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

miRNA功能研究的重點在于對其靶基因調(diào)控的研究。miRNA通過精確地調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡等生物學(xué)過程。通過實驗結(jié)合生物信息學(xué)的方法，2009年Friedman等[24]預(yù)測，miRNA作用的靶基因數(shù)量超過45 000個，調(diào)控了人類2/3以上的蛋白質(zhì)編碼基因。一個miRNA可以有不同的靶基因，一個靶基因也可以由多個miRNA調(diào)控。通常認(rèn)為，受多個miRNA同時作用靶基因更有可能發(fā)揮重要作用[25]。筆者最終篩選出9個miRNA的靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148)，其中SOX11、PHF20基因被認(rèn)為與骨的生長、發(fā)育相關(guān)。SOX11基因在許多干細(xì)胞中都有表達(dá)，包括骨祖細(xì)胞，在細(xì)胞的發(fā)育過程中，SOX11基因?qū)τ诩?xì)胞的存活和分化起了重要作用，并能通過誘導(dǎo)生長板的形成促進(jìn)骨骼生長[26]。SOX11基因過表達(dá)可以顯著促進(jìn)老鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[27]，機(jī)制可能是通過促進(jìn)成骨細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化[28]。大鼠全身性敲低PHF20基因會表現(xiàn)出腰椎發(fā)育異常[29]，研究其發(fā)病的具體機(jī)制，Yang等[30]通過過表達(dá)PHF20基因，發(fā)現(xiàn)它可以增加ALP活性和骨礦化形成，及骨形成標(biāo)志物Runx2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。相反，抑制PHF20表達(dá)會降低骨形成及骨礦化作用。

綜上所述，本實驗采用miRNA芯片技術(shù)研究PMOP腎陰虛證中差異表達(dá)miRNA，并對這些miRNA進(jìn)行pathway分析及靶基因預(yù)測。結(jié)果表明，這些差異表達(dá)miRNA可能通過調(diào)控PI3K-Akt、MAPK、Wnt信號通路等與骨代謝相關(guān)信號通路參與PMOP腎陰虛證的發(fā)生發(fā)展過程。這只是對PMOP腎陰虛證miRNA基因表達(dá)譜的初步探討，今后需要擴(kuò)大樣本驗證miRNA，及進(jìn)一步探討miRNA與靶基因的關(guān)系，并對miRNA進(jìn)行體內(nèi)實驗功能驗證。通過對差異miRNA及其調(diào)控的靶基因深入研究，將有助于理解PMOP腎陰虛證的本質(zhì)及為治療提供新的思路與方法。