5’-脫氧氟尿苷聯(lián)合干擾素對(duì)轉(zhuǎn)染TP基因結(jié)腸癌細(xì)胞株裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠绊?/h1>
2018-01-19 09:08:02王綺雯張繼民
中國(guó)癌癥雜志 2017年11期
方 耿，王綺雯，張繼民
廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510260
胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)在組織內(nèi)具有促血管新生活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移起重要作用。同時(shí)還是氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)前體類(lèi)藥物，如5’-脫氧氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine，5’-DFUR)、卡培他濱(capecitabine)等在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒作用5-FU的關(guān)鍵限速酶。已有研究表明，TP在人乳腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)［1］，但在結(jié)直腸癌組織中，TP主要表達(dá)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)顆粒而非癌細(xì)胞。我們的前期研究已經(jīng)通過(guò)給結(jié)腸癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染TP基因建立了TP高表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株［2］。本研究旨在探索結(jié)腸癌TP高、低表達(dá)細(xì)胞株在裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭心[瘤組織生長(zhǎng)差異及對(duì)5-FU、5’-DFUR并聯(lián)合干擾素-α2a(interferonα2a，INF-α2a)進(jìn)行干預(yù)的不同影響。
1 材料和方法
1.1 細(xì)胞系、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑
人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系LS174T購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。BALB/c裸小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共96只，雄性，5～6周，18～20 g。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶和乙二胺四乙酸購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TP基因慢病毒載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，5-FU和5’-DFUR購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，INF-α2a購(gòu)自瑞士Roche公司，鼠抗人CD34、PD-ECGF(SPM322)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，S-P二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 基因轉(zhuǎn)染
結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T計(jì)數(shù)鋪板，24 h細(xì)胞貼壁后，按MOI=20計(jì)算病毒液體積加入，同時(shí)加入終濃度為8 μg/mL的凝聚胺，溫育8 h后更換完全培養(yǎng)基。病毒感染48 h后，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)到第2天用含有殺稻瘟菌素8 μg/mL的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每3天換液1次，持續(xù)篩選2周，于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代，傳5代以上得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白細(xì)胞的百分比，從而得出慢病毒的感染效率。
1.2.2 裸鼠皮下荷瘤模型建立
選用人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞株，通過(guò)轉(zhuǎn)染TP cDNA，得到可以穩(wěn)定傳代的高TP表達(dá)細(xì)胞株［2］。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度為1×107個(gè)/mL。將96只裸鼠分為2組，每組48只分別接種LS174T及LS174-TP細(xì)胞。每只裸鼠右前肢背部皮下注射細(xì)胞懸液0.2 mL。3 d后接種部位可觸及腫瘤組織。
1.2.3 分組干預(yù)
將分別接種LS174T及LS174-TP細(xì)胞的48只裸鼠再隨機(jī)分成6組，每組8只，接種后2 d開(kāi)始給藥干預(yù)，連續(xù)5 d。① 對(duì)照組：每天腹腔注射0.9%NaCl溶液0.4 mL；② INF-α2a組：第1天INF-α2a 2 μg皮下注射1次，并每天腹腔注射0.9%NaCl溶液0.4 mL；③ 5-FU組：每天腹腔注射5-FU 15 mg/kg；④ 5-FU+INF-α2a組：第1天INF-α2a 2 μg皮下注射1次，并每天腹腔注射5-FU 15 mg/kg；⑤ 5’-DFUR組：每天腹腔注射5’-DFUR 20 mg/kg；⑥ 5’-DFUR+INF-α2a組：第1天INF-α2a 2 μg皮下注射1次，每天腹腔注射5’-DFUR 20 mg/kg。
1.2.4 觀測(cè)指標(biāo)及處死留取標(biāo)本
所有裸鼠于接種結(jié)腸癌細(xì)胞2 d后開(kāi)始給藥干預(yù)。從給藥當(dāng)天開(kāi)始每天測(cè)量體質(zhì)量，給藥結(jié)束次日(第6天)計(jì)算給藥前后裸鼠的體質(zhì)量變化，體質(zhì)量變化值=給藥后體質(zhì)量-給藥前體質(zhì)量，體質(zhì)量比接種前增加的數(shù)值標(biāo)記為正值，降低的標(biāo)記為負(fù)值。第14天處死全部裸鼠后分離皮下腫瘤組織，稱取重量并記錄。抑癌率=［(對(duì)照組腫瘤質(zhì)量均值-處理組腫瘤質(zhì)量均值)÷對(duì)照組腫瘤質(zhì)量均值］×100%。切除的腫瘤標(biāo)本置于4%甲醛溶液中固定，制成石蠟塊準(zhǔn)備行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
1.2.5 免疫組織化學(xué)染色分析
將全部接種LS174T和LS174-TP細(xì)胞的裸鼠腫瘤標(biāo)本石蠟包塊切成厚5 μm的切片，分別應(yīng)用表達(dá)TP的鼠抗人PD-ECGF和表達(dá)微血管的鼠抗人CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的單克隆抗體，按即用型S-P二步法試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。PD-ECGF陽(yáng)性細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核黃染，偶爾也可以看到單獨(dú)細(xì)胞核黃染。TP表達(dá)水平的判斷標(biāo)準(zhǔn)為一個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)50%以上則認(rèn)為該標(biāo)本為陽(yáng)性標(biāo)本。CD34和VEGF陽(yáng)性的微血管計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為任何1個(gè)單個(gè)黃染細(xì)胞或一串可與其他細(xì)胞明確分開(kāi)的內(nèi)皮細(xì)胞集團(tuán)，判定為1個(gè)單獨(dú)的血管。先在200倍視野下選擇5處陽(yáng)性細(xì)胞或微血管最密集區(qū)，然后在400倍視野下(0.062 5 mm2)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出每份標(biāo)本微血管的x±s。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
2 結(jié) 果
2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型觀察
96只裸鼠接種結(jié)腸癌細(xì)胞后全部存活，3 d后即可在接種部位皮下觸及腫瘤結(jié)節(jié)，成瘤率為100%(圖1)。干預(yù)給藥后對(duì)照組、INF-α2a組一般情況與給藥前差異不顯著，但其余4組均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、腹瀉及體質(zhì)量減輕。
圖1 裸鼠接種細(xì)胞株后2周處死時(shí)腫瘤模型Fig. 1 The tumor graft in nude mouse after transplanted LS174T for 2 weeks
2.2 裸鼠體質(zhì)量變化
干預(yù)給藥前，各組裸鼠體質(zhì)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5 d給藥結(jié)束后，與對(duì)照組相比，5-FU組與5-FU+INF-α2a組體質(zhì)量明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5’-DFUR組與5’-DFUR+INF-α2a組體質(zhì)量也輕度降低，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1，圖2、3)。
表 1 實(shí)驗(yàn)裸鼠藥物干預(yù)5天后體質(zhì)量變化Tab. 1 The weight varieties of nude mice intervened by antitumor agents 5 days later
表 1 實(shí)驗(yàn)裸鼠藥物干預(yù)5天后體質(zhì)量變化Tab. 1 The weight varieties of nude mice intervened by antitumor agents 5 days later
*: P＜0.05, compared with control group
Group (n=6) Inoculate LS174T Inoculate LS174T-TP 0.9%NaCl 0.97±0.39 0.65±1.13 INF-α2a 1.40±0.66 1.31±1.21 5-FU -1.83±0.71* -0.93±1.34*5-FU+INF-α2a -3.45±0.73* -1.76±2.07*5’-DFUR -0.90±2.90 -0.81±3.26 5’-DFUR+INF-α2a -0.67±2.24 0.54±0.90
圖 2 接種LS174T細(xì)胞株后各組裸鼠體質(zhì)量變化Fig. 2 The weight varieties in each group of LS174T transplanted nude mice intervened by antitumor agents
圖3 接種LS174T-TP細(xì)胞株后各組裸鼠體質(zhì)量變化Fig. 3 The weight varieties in each group of LS174T-TP transplanted nude mice intervened by antitumor agents
2.3 腫瘤質(zhì)量比較
分別接種轉(zhuǎn)染TP基因LS174T-TP和野生型LS174T的兩組實(shí)驗(yàn)裸鼠中，僅注射0.9%NaCl溶液的兩組腫瘤質(zhì)量分別為(0.41±0.06) g和(0.92±0.15) g，轉(zhuǎn)染TP基因后的腫瘤質(zhì)量明顯大于野生細(xì)胞組(P＜0.05)。在野生型細(xì)胞裸鼠荷瘤模型中，應(yīng)用INF-α2a組裸鼠腫瘤質(zhì)量比對(duì)照組腫瘤質(zhì)量輕度降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而應(yīng)用5-FU組、5’-DFUR組及5’-DFUR+INF-α2a組腫瘤質(zhì)量與對(duì)照組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。其中5’-DFUR+INF-α2a組腫瘤減輕作用最為明顯，抑癌率高達(dá)57%。而5-FU組和5-FU+INF-α2a組的抑癌率也分別為48%和27%，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。單純比較5-FU組與5’-DFUR組抑癌率均為48%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
表 2 接種LS174T細(xì)胞裸鼠不同藥物干預(yù)后腫瘤質(zhì)量Tab. 2 The tumor weights in LS174T-transplanted nude mice intervened by antitumor
在轉(zhuǎn)染型LS174T-TP細(xì)胞株裸小鼠荷瘤模型中，注射5-FU和5-FU+INF-α2a的兩組抑癌率分別為7%和3%，與對(duì)照組相比并未顯示出良好的抗腫瘤效果(P＞0.05)。而5’-DFUR組和5’-DFUR+INF-α2a組腫瘤質(zhì)量明顯減少，抑癌率分別為27%和48%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05，表3)。
2.4 腫瘤組織中TP表達(dá)及微血管生成
接種LS174T原代細(xì)胞的裸鼠腫瘤組織中，TP表達(dá)為陰性(圖4A)，聯(lián)合應(yīng)用INF-α2a組的TP表達(dá)亦未見(jiàn)明顯增加(圖4B)。而接種轉(zhuǎn)染TP基因的LS174T-TP細(xì)胞組(圖4C)和同時(shí)應(yīng)用INF-α2a組(圖4D)的TP表達(dá)均呈強(qiáng)陽(yáng)性。單純接種LS174T細(xì)胞及聯(lián)合應(yīng)用INF-α2a裸鼠腫瘤組織中有VEGF表達(dá)，也有新生血管生成，但VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及微血管數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。但接種轉(zhuǎn)染TP基因LS174T細(xì)胞裸鼠腫瘤組織中，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞和新生血管數(shù)目均明顯增多，與接種原代細(xì)胞裸鼠腫瘤組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但接種LS174T-TP細(xì)胞并聯(lián)合應(yīng)用INF-α2a后，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞、微血管數(shù)目與未用INF-α2a組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖5，表4)。
表 3 接種LS174T-TP細(xì)胞裸鼠不同藥物干預(yù)后腫瘤質(zhì)量Tab. 3 The tumor weight of TP-transfected nude mice intervened by antitumor agents
圖 4 裸鼠腫瘤組織中TP表達(dá)Fig. 4 The TP expression in tumor tissues of nude mice
圖 5 腫瘤組織中VEGF、CD34表達(dá)Fig. 5 The expression of VEGF, CD34 in tumor tissues
表 4 裸鼠腫瘤組織中VEGF陽(yáng)性細(xì)胞和微血管數(shù)量Tab. 4 The numbers of VEGF-positive cells and microvessels in tumor tissues of LS174T/LS174T-TP-transplanted nude mice(/0.062 5 mm2，x±s)
3 討 論
TP是核酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，分子結(jié)構(gòu)是由兩條多肽鏈構(gòu)成的同源二聚體。目前研究結(jié)果普遍認(rèn)為T(mén)P與PD-ECGF是同一物質(zhì)，在體內(nèi)具有促進(jìn)血管生成作用，其高表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后相關(guān)［3］。既往研究表明，TP在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)明顯高于周?chē)＝M織，但在結(jié)直腸癌組織中是腫瘤細(xì)胞表達(dá)還是間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)尚無(wú)定論。Zhang等［4］曾對(duì)40例結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中的TP活性明顯高于周?chē)＝M織，但結(jié)直腸癌細(xì)胞本身基本無(wú)表達(dá)，而主要由癌巢周邊腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)。對(duì)6株結(jié)腸癌細(xì)胞系采用ELISA法測(cè)定TP蛋白水準(zhǔn)也證實(shí)上述推斷。此外，TP還是5-FU前體類(lèi)藥物5’-DFUR、CAP等在人體內(nèi)活化的關(guān)鍵酶，此類(lèi)藥物自身沒(méi)有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，需要在腫瘤組織內(nèi)TP的催化下轉(zhuǎn)化為5-FU從而發(fā)揮抗腫瘤作用，因此，提高結(jié)直腸癌組織內(nèi)TP的表達(dá)可以提高5’-DFUR等化療藥物的敏感性，在臨床治療上具有重要的作用。Ogata等［5］曾對(duì)45例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者服用5’-DFUR聯(lián)合低劑量伊立替康的研究顯示，5’-DFUR在TP高度表達(dá)的患者中有效率為47%，明顯高于低表達(dá)患者的19%。
由于結(jié)腸癌細(xì)胞很少表達(dá)TP，為增強(qiáng)5-FU前體類(lèi)藥物在結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗癌效應(yīng)，我們?cè)谇捌谘芯恐幸恢眹L試各種方法增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的TP表達(dá)，Zhang等［6］最早把6株結(jié)腸癌細(xì)胞株同類(lèi)巨噬細(xì)胞株THP-1和U937一起培養(yǎng)，結(jié)果使6株結(jié)腸癌細(xì)胞株的TP蛋白水準(zhǔn)明顯提高，并且使5’-DFUR的半數(shù)有效劑量分別下降到原來(lái)的5.4%～41.8%。之后夏強(qiáng)等［7］應(yīng)用IFN-α2a刺激人結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO和SW480，使其TP mRNA水平分別增高了1.59倍和4.85倍，并且在體外實(shí)驗(yàn)中明顯增強(qiáng)5’-DFUR抗結(jié)腸癌細(xì)胞活性。劉劍等［8］、高慶等［9］和葉鈿均等［10］利用慢病毒作為載體分別轉(zhuǎn)染TP基因給結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、LOVO、HT29和LS174T，結(jié)果4株細(xì)胞內(nèi)TP mRNA和TP蛋白表達(dá)均明顯增高，使5’-DFUR的抗癌活性明顯增加。劉奇等［11］進(jìn)一步針對(duì)轉(zhuǎn)染TP基因的結(jié)腸癌細(xì)胞，在應(yīng)用5’-DFUR干擾的同時(shí)，同時(shí)應(yīng)用INF-α2a，使細(xì)胞內(nèi)TP蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高，5’-DFUR的抗癌活性進(jìn)一步增強(qiáng)。以上前期研究結(jié)果均為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，而轉(zhuǎn)染TP基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的癌組織中，是否可增高TP表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)5’-DFUR的抗癌活性，INF-α2a是否可以進(jìn)一步上調(diào)TP表達(dá)并增強(qiáng)5’-DFUR抗癌活性，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
本研究將人結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T轉(zhuǎn)染TP基因，得到可以穩(wěn)定傳代的TP高表達(dá)細(xì)胞株后，分別應(yīng)用原代細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染TP基因的細(xì)胞株制作裸鼠皮下荷瘤模型。通過(guò)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TP基因的裸鼠腫瘤組織中TP表達(dá)量顯著提高，腫瘤組織中的微血管密度增加，Sivridis等［12］認(rèn)為通過(guò)提高TP表達(dá)水平能夠促進(jìn)血管新生進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。藥物干預(yù)組中所有裸鼠的體質(zhì)量與對(duì)照組及干擾素組相比均下降，但是應(yīng)用5-FU組及5-FU+干擾素組的比重下降比較明顯(P＜0.05)，提示5-FU對(duì)生理的干擾明顯大于5’-DFUR。在抗腫瘤效果方面，單獨(dú)應(yīng)用5-FU或5’-DFUR對(duì)原代LS174T細(xì)胞接種的裸鼠腫瘤組織均有抑制生長(zhǎng)作用(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染TP基因的LS174T-TP裸鼠模型則僅對(duì)5’-DFUR敏感，提示當(dāng)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞即便高表達(dá)TP，但5-FU在細(xì)胞內(nèi)的含量無(wú)改變，增多的新生血管促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，部分抵消了5-FU的細(xì)胞抑制作用。而5’-DFUR則由增高的TP表達(dá)增多了腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化的5-FU使其更具有靶向治療作用。當(dāng)單獨(dú)應(yīng)用5’-DFUR及聯(lián)合IFN-α2a時(shí)，對(duì)兩種裸鼠腫瘤模型生長(zhǎng)均具有抑制作用，并且腫瘤質(zhì)量較其他各組都顯著減小(P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到了臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證，Ishii等［13］曾在Ⅲ期胃癌的臨床試驗(yàn)中證實(shí)，在TP高表達(dá)的患者中，服用5’-DFUR者比服用5-FU者生存期更長(zhǎng)。Zhu等［14］的研究證明了INF-α2a能激活ERK信號(hào)通路，上調(diào)胃癌細(xì)胞株的TP蛋白表達(dá)從而增強(qiáng)5’-DFUR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。即干擾素能夠上調(diào)腫瘤組織中TP的表達(dá)量從而與5’-DFUR發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤生長(zhǎng)的作用。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，使用INF-α2a的裸鼠模型中腫瘤組織TP表達(dá)較對(duì)照組有提高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，可能是由于我們樣本量不夠大或免疫組織化學(xué)不足以顯示出這種差異所致。單獨(dú)應(yīng)用5-FU及聯(lián)合INF-α2a時(shí)，兩者聯(lián)合用藥抑制腫瘤的效果沒(méi)有表現(xiàn)出比單用5-FU更好的抗癌效果，肖永勝等［15］也在裸鼠肝癌模型上證實(shí)了IFN-α2a與5-FU之間在抗腫瘤方面無(wú)協(xié)同作用，Link等［16］的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在5-FU+左旋咪唑化療方案中，同時(shí)應(yīng)用IFN-α2a并不能延長(zhǎng)總生存期。
本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T的裸鼠荷瘤模型中，通過(guò)轉(zhuǎn)染TP基因能夠提高TP在腫瘤中的表達(dá)，使5’-DFUR能夠發(fā)揮更好的抗腫瘤作用，而聯(lián)用INF-α2a能使5’-DFUR的抗腫瘤效果進(jìn)一步增加。提示對(duì)于結(jié)直腸癌患者，尤其是在TP高表達(dá)患者中，口服5’-DFUR、卡培他濱等5-FU前體類(lèi)化療藥物的同時(shí)聯(lián)用INF-α2a有可能獲得更好的療效。但是轉(zhuǎn)染TP基因也可使腫瘤組織內(nèi)新生血管增多，有利于腫瘤生長(zhǎng)，如何權(quán)衡其雙向作用，達(dá)到有效抑制腫瘤生長(zhǎng)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
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方 耿，王綺雯，張繼民
廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510260
胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)在組織內(nèi)具有促血管新生活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移起重要作用。同時(shí)還是氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)前體類(lèi)藥物，如5’-脫氧氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine，5’-DFUR)、卡培他濱(capecitabine)等在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒作用5-FU的關(guān)鍵限速酶。已有研究表明，TP在人乳腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)［1］，但在結(jié)直腸癌組織中，TP主要表達(dá)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)顆粒而非癌細(xì)胞。我們的前期研究已經(jīng)通過(guò)給結(jié)腸癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染TP基因建立了TP高表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株［2］。本研究旨在探索結(jié)腸癌TP高、低表達(dá)細(xì)胞株在裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭心[瘤組織生長(zhǎng)差異及對(duì)5-FU、5’-DFUR并聯(lián)合干擾素-α2a(interferonα2a，INF-α2a)進(jìn)行干預(yù)的不同影響。
1 材料和方法
1.1 細(xì)胞系、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑
人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系LS174T購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。BALB/c裸小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共96只，雄性，5～6周，18～20 g。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶和乙二胺四乙酸購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TP基因慢病毒載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，5-FU和5’-DFUR購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，INF-α2a購(gòu)自瑞士Roche公司，鼠抗人CD34、PD-ECGF(SPM322)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，S-P二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 基因轉(zhuǎn)染
結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T計(jì)數(shù)鋪板，24 h細(xì)胞貼壁后，按MOI=20計(jì)算病毒液體積加入，同時(shí)加入終濃度為8 μg/mL的凝聚胺，溫育8 h后更換完全培養(yǎng)基。病毒感染48 h后，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)到第2天用含有殺稻瘟菌素8 μg/mL的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每3天換液1次，持續(xù)篩選2周，于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代，傳5代以上得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白細(xì)胞的百分比，從而得出慢病毒的感染效率。
1.2.2 裸鼠皮下荷瘤模型建立
選用人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞株，通過(guò)轉(zhuǎn)染TP cDNA，得到可以穩(wěn)定傳代的高TP表達(dá)細(xì)胞株［2］。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度為1×107個(gè)/mL。將96只裸鼠分為2組，每組48只分別接種LS174T及LS174-TP細(xì)胞。每只裸鼠右前肢背部皮下注射細(xì)胞懸液0.2 mL。3 d后接種部位可觸及腫瘤組織。
1.2.3 分組干預(yù)
將分別接種LS174T及LS174-TP細(xì)胞的48只裸鼠再隨機(jī)分成6組，每組8只，接種后2 d開(kāi)始給藥干預(yù)，連續(xù)5 d。① 對(duì)照組：每天腹腔注射0.9%NaCl溶液0.4 mL；② INF-α2a組：第1天INF-α2a 2 μg皮下注射1次，并每天腹腔注射0.9%NaCl溶液0.4 mL；③ 5-FU組：每天腹腔注射5-FU 15 mg/kg；④ 5-FU+INF-α2a組：第1天INF-α2a 2 μg皮下注射1次，并每天腹腔注射5-FU 15 mg/kg；⑤ 5’-DFUR組：每天腹腔注射5’-DFUR 20 mg/kg；⑥ 5’-DFUR+INF-α2a組：第1天INF-α2a 2 μg皮下注射1次，每天腹腔注射5’-DFUR 20 mg/kg。
1.2.4 觀測(cè)指標(biāo)及處死留取標(biāo)本
所有裸鼠于接種結(jié)腸癌細(xì)胞2 d后開(kāi)始給藥干預(yù)。從給藥當(dāng)天開(kāi)始每天測(cè)量體質(zhì)量，給藥結(jié)束次日(第6天)計(jì)算給藥前后裸鼠的體質(zhì)量變化，體質(zhì)量變化值=給藥后體質(zhì)量-給藥前體質(zhì)量，體質(zhì)量比接種前增加的數(shù)值標(biāo)記為正值，降低的標(biāo)記為負(fù)值。第14天處死全部裸鼠后分離皮下腫瘤組織，稱取重量并記錄。抑癌率=［(對(duì)照組腫瘤質(zhì)量均值-處理組腫瘤質(zhì)量均值)÷對(duì)照組腫瘤質(zhì)量均值］×100%。切除的腫瘤標(biāo)本置于4%甲醛溶液中固定，制成石蠟塊準(zhǔn)備行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
1.2.5 免疫組織化學(xué)染色分析
將全部接種LS174T和LS174-TP細(xì)胞的裸鼠腫瘤標(biāo)本石蠟包塊切成厚5 μm的切片，分別應(yīng)用表達(dá)TP的鼠抗人PD-ECGF和表達(dá)微血管的鼠抗人CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的單克隆抗體，按即用型S-P二步法試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。PD-ECGF陽(yáng)性細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核黃染，偶爾也可以看到單獨(dú)細(xì)胞核黃染。TP表達(dá)水平的判斷標(biāo)準(zhǔn)為一個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)50%以上則認(rèn)為該標(biāo)本為陽(yáng)性標(biāo)本。CD34和VEGF陽(yáng)性的微血管計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為任何1個(gè)單個(gè)黃染細(xì)胞或一串可與其他細(xì)胞明確分開(kāi)的內(nèi)皮細(xì)胞集團(tuán)，判定為1個(gè)單獨(dú)的血管。先在200倍視野下選擇5處陽(yáng)性細(xì)胞或微血管最密集區(qū)，然后在400倍視野下(0.062 5 mm2)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出每份標(biāo)本微血管的x±s。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
2 結(jié) 果
2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型觀察
96只裸鼠接種結(jié)腸癌細(xì)胞后全部存活，3 d后即可在接種部位皮下觸及腫瘤結(jié)節(jié)，成瘤率為100%(圖1)。干預(yù)給藥后對(duì)照組、INF-α2a組一般情況與給藥前差異不顯著，但其余4組均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、腹瀉及體質(zhì)量減輕。
圖1 裸鼠接種細(xì)胞株后2周處死時(shí)腫瘤模型Fig. 1 The tumor graft in nude mouse after transplanted LS174T for 2 weeks
2.2 裸鼠體質(zhì)量變化
干預(yù)給藥前，各組裸鼠體質(zhì)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5 d給藥結(jié)束后，與對(duì)照組相比，5-FU組與5-FU+INF-α2a組體質(zhì)量明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5’-DFUR組與5’-DFUR+INF-α2a組體質(zhì)量也輕度降低，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1，圖2、3)。
表 1 實(shí)驗(yàn)裸鼠藥物干預(yù)5天后體質(zhì)量變化Tab. 1 The weight varieties of nude mice intervened by antitumor agents 5 days later
表 1 實(shí)驗(yàn)裸鼠藥物干預(yù)5天后體質(zhì)量變化Tab. 1 The weight varieties of nude mice intervened by antitumor agents 5 days later
*: P＜0.05, compared with control group
Group (n=6) Inoculate LS174T Inoculate LS174T-TP 0.9%NaCl 0.97±0.39 0.65±1.13 INF-α2a 1.40±0.66 1.31±1.21 5-FU -1.83±0.71* -0.93±1.34*5-FU+INF-α2a -3.45±0.73* -1.76±2.07*5’-DFUR -0.90±2.90 -0.81±3.26 5’-DFUR+INF-α2a -0.67±2.24 0.54±0.90
圖 2 接種LS174T細(xì)胞株后各組裸鼠體質(zhì)量變化Fig. 2 The weight varieties in each group of LS174T transplanted nude mice intervened by antitumor agents
圖3 接種LS174T-TP細(xì)胞株后各組裸鼠體質(zhì)量變化Fig. 3 The weight varieties in each group of LS174T-TP transplanted nude mice intervened by antitumor agents
2.3 腫瘤質(zhì)量比較
分別接種轉(zhuǎn)染TP基因LS174T-TP和野生型LS174T的兩組實(shí)驗(yàn)裸鼠中，僅注射0.9%NaCl溶液的兩組腫瘤質(zhì)量分別為(0.41±0.06) g和(0.92±0.15) g，轉(zhuǎn)染TP基因后的腫瘤質(zhì)量明顯大于野生細(xì)胞組(P＜0.05)。在野生型細(xì)胞裸鼠荷瘤模型中，應(yīng)用INF-α2a組裸鼠腫瘤質(zhì)量比對(duì)照組腫瘤質(zhì)量輕度降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而應(yīng)用5-FU組、5’-DFUR組及5’-DFUR+INF-α2a組腫瘤質(zhì)量與對(duì)照組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。其中5’-DFUR+INF-α2a組腫瘤減輕作用最為明顯，抑癌率高達(dá)57%。而5-FU組和5-FU+INF-α2a組的抑癌率也分別為48%和27%，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。單純比較5-FU組與5’-DFUR組抑癌率均為48%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
表 2 接種LS174T細(xì)胞裸鼠不同藥物干預(yù)后腫瘤質(zhì)量Tab. 2 The tumor weights in LS174T-transplanted nude mice intervened by antitumor
在轉(zhuǎn)染型LS174T-TP細(xì)胞株裸小鼠荷瘤模型中，注射5-FU和5-FU+INF-α2a的兩組抑癌率分別為7%和3%，與對(duì)照組相比并未顯示出良好的抗腫瘤效果(P＞0.05)。而5’-DFUR組和5’-DFUR+INF-α2a組腫瘤質(zhì)量明顯減少，抑癌率分別為27%和48%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05，表3)。
2.4 腫瘤組織中TP表達(dá)及微血管生成
接種LS174T原代細(xì)胞的裸鼠腫瘤組織中，TP表達(dá)為陰性(圖4A)，聯(lián)合應(yīng)用INF-α2a組的TP表達(dá)亦未見(jiàn)明顯增加(圖4B)。而接種轉(zhuǎn)染TP基因的LS174T-TP細(xì)胞組(圖4C)和同時(shí)應(yīng)用INF-α2a組(圖4D)的TP表達(dá)均呈強(qiáng)陽(yáng)性。單純接種LS174T細(xì)胞及聯(lián)合應(yīng)用INF-α2a裸鼠腫瘤組織中有VEGF表達(dá)，也有新生血管生成，但VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及微血管數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。但接種轉(zhuǎn)染TP基因LS174T細(xì)胞裸鼠腫瘤組織中，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞和新生血管數(shù)目均明顯增多，與接種原代細(xì)胞裸鼠腫瘤組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但接種LS174T-TP細(xì)胞并聯(lián)合應(yīng)用INF-α2a后，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞、微血管數(shù)目與未用INF-α2a組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖5，表4)。
表 3 接種LS174T-TP細(xì)胞裸鼠不同藥物干預(yù)后腫瘤質(zhì)量Tab. 3 The tumor weight of TP-transfected nude mice intervened by antitumor agents
圖 4 裸鼠腫瘤組織中TP表達(dá)Fig. 4 The TP expression in tumor tissues of nude mice
圖 5 腫瘤組織中VEGF、CD34表達(dá)Fig. 5 The expression of VEGF, CD34 in tumor tissues
表 4 裸鼠腫瘤組織中VEGF陽(yáng)性細(xì)胞和微血管數(shù)量Tab. 4 The numbers of VEGF-positive cells and microvessels in tumor tissues of LS174T/LS174T-TP-transplanted nude mice(/0.062 5 mm2，x±s)
3 討 論
TP是核酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，分子結(jié)構(gòu)是由兩條多肽鏈構(gòu)成的同源二聚體。目前研究結(jié)果普遍認(rèn)為T(mén)P與PD-ECGF是同一物質(zhì)，在體內(nèi)具有促進(jìn)血管生成作用，其高表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后相關(guān)［3］。既往研究表明，TP在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)明顯高于周?chē)＝M織，但在結(jié)直腸癌組織中是腫瘤細(xì)胞表達(dá)還是間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)尚無(wú)定論。Zhang等［4］曾對(duì)40例結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中的TP活性明顯高于周?chē)＝M織，但結(jié)直腸癌細(xì)胞本身基本無(wú)表達(dá)，而主要由癌巢周邊腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)。對(duì)6株結(jié)腸癌細(xì)胞系采用ELISA法測(cè)定TP蛋白水準(zhǔn)也證實(shí)上述推斷。此外，TP還是5-FU前體類(lèi)藥物5’-DFUR、CAP等在人體內(nèi)活化的關(guān)鍵酶，此類(lèi)藥物自身沒(méi)有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，需要在腫瘤組織內(nèi)TP的催化下轉(zhuǎn)化為5-FU從而發(fā)揮抗腫瘤作用，因此，提高結(jié)直腸癌組織內(nèi)TP的表達(dá)可以提高5’-DFUR等化療藥物的敏感性，在臨床治療上具有重要的作用。Ogata等［5］曾對(duì)45例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者服用5’-DFUR聯(lián)合低劑量伊立替康的研究顯示，5’-DFUR在TP高度表達(dá)的患者中有效率為47%，明顯高于低表達(dá)患者的19%。
由于結(jié)腸癌細(xì)胞很少表達(dá)TP，為增強(qiáng)5-FU前體類(lèi)藥物在結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗癌效應(yīng)，我們?cè)谇捌谘芯恐幸恢眹L試各種方法增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的TP表達(dá)，Zhang等［6］最早把6株結(jié)腸癌細(xì)胞株同類(lèi)巨噬細(xì)胞株THP-1和U937一起培養(yǎng)，結(jié)果使6株結(jié)腸癌細(xì)胞株的TP蛋白水準(zhǔn)明顯提高，并且使5’-DFUR的半數(shù)有效劑量分別下降到原來(lái)的5.4%～41.8%。之后夏強(qiáng)等［7］應(yīng)用IFN-α2a刺激人結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO和SW480，使其TP mRNA水平分別增高了1.59倍和4.85倍，并且在體外實(shí)驗(yàn)中明顯增強(qiáng)5’-DFUR抗結(jié)腸癌細(xì)胞活性。劉劍等［8］、高慶等［9］和葉鈿均等［10］利用慢病毒作為載體分別轉(zhuǎn)染TP基因給結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、LOVO、HT29和LS174T，結(jié)果4株細(xì)胞內(nèi)TP mRNA和TP蛋白表達(dá)均明顯增高，使5’-DFUR的抗癌活性明顯增加。劉奇等［11］進(jìn)一步針對(duì)轉(zhuǎn)染TP基因的結(jié)腸癌細(xì)胞，在應(yīng)用5’-DFUR干擾的同時(shí)，同時(shí)應(yīng)用INF-α2a，使細(xì)胞內(nèi)TP蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高，5’-DFUR的抗癌活性進(jìn)一步增強(qiáng)。以上前期研究結(jié)果均為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，而轉(zhuǎn)染TP基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的癌組織中，是否可增高TP表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)5’-DFUR的抗癌活性，INF-α2a是否可以進(jìn)一步上調(diào)TP表達(dá)并增強(qiáng)5’-DFUR抗癌活性，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
本研究將人結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T轉(zhuǎn)染TP基因，得到可以穩(wěn)定傳代的TP高表達(dá)細(xì)胞株后，分別應(yīng)用原代細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染TP基因的細(xì)胞株制作裸鼠皮下荷瘤模型。通過(guò)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TP基因的裸鼠腫瘤組織中TP表達(dá)量顯著提高，腫瘤組織中的微血管密度增加，Sivridis等［12］認(rèn)為通過(guò)提高TP表達(dá)水平能夠促進(jìn)血管新生進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。藥物干預(yù)組中所有裸鼠的體質(zhì)量與對(duì)照組及干擾素組相比均下降，但是應(yīng)用5-FU組及5-FU+干擾素組的比重下降比較明顯(P＜0.05)，提示5-FU對(duì)生理的干擾明顯大于5’-DFUR。在抗腫瘤效果方面，單獨(dú)應(yīng)用5-FU或5’-DFUR對(duì)原代LS174T細(xì)胞接種的裸鼠腫瘤組織均有抑制生長(zhǎng)作用(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染TP基因的LS174T-TP裸鼠模型則僅對(duì)5’-DFUR敏感，提示當(dāng)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞即便高表達(dá)TP，但5-FU在細(xì)胞內(nèi)的含量無(wú)改變，增多的新生血管促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，部分抵消了5-FU的細(xì)胞抑制作用。而5’-DFUR則由增高的TP表達(dá)增多了腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化的5-FU使其更具有靶向治療作用。當(dāng)單獨(dú)應(yīng)用5’-DFUR及聯(lián)合IFN-α2a時(shí)，對(duì)兩種裸鼠腫瘤模型生長(zhǎng)均具有抑制作用，并且腫瘤質(zhì)量較其他各組都顯著減小(P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到了臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證，Ishii等［13］曾在Ⅲ期胃癌的臨床試驗(yàn)中證實(shí)，在TP高表達(dá)的患者中，服用5’-DFUR者比服用5-FU者生存期更長(zhǎng)。Zhu等［14］的研究證明了INF-α2a能激活ERK信號(hào)通路，上調(diào)胃癌細(xì)胞株的TP蛋白表達(dá)從而增強(qiáng)5’-DFUR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。即干擾素能夠上調(diào)腫瘤組織中TP的表達(dá)量從而與5’-DFUR發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤生長(zhǎng)的作用。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，使用INF-α2a的裸鼠模型中腫瘤組織TP表達(dá)較對(duì)照組有提高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，可能是由于我們樣本量不夠大或免疫組織化學(xué)不足以顯示出這種差異所致。單獨(dú)應(yīng)用5-FU及聯(lián)合INF-α2a時(shí)，兩者聯(lián)合用藥抑制腫瘤的效果沒(méi)有表現(xiàn)出比單用5-FU更好的抗癌效果，肖永勝等［15］也在裸鼠肝癌模型上證實(shí)了IFN-α2a與5-FU之間在抗腫瘤方面無(wú)協(xié)同作用，Link等［16］的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在5-FU+左旋咪唑化療方案中，同時(shí)應(yīng)用IFN-α2a并不能延長(zhǎng)總生存期。
本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T的裸鼠荷瘤模型中，通過(guò)轉(zhuǎn)染TP基因能夠提高TP在腫瘤中的表達(dá)，使5’-DFUR能夠發(fā)揮更好的抗腫瘤作用，而聯(lián)用INF-α2a能使5’-DFUR的抗腫瘤效果進(jìn)一步增加。提示對(duì)于結(jié)直腸癌患者，尤其是在TP高表達(dá)患者中，口服5’-DFUR、卡培他濱等5-FU前體類(lèi)化療藥物的同時(shí)聯(lián)用INF-α2a有可能獲得更好的療效。但是轉(zhuǎn)染TP基因也可使腫瘤組織內(nèi)新生血管增多，有利于腫瘤生長(zhǎng)，如何權(quán)衡其雙向作用，達(dá)到有效抑制腫瘤生長(zhǎng)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
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