肖華平，謝 輝，羅春陽(yáng)，李 慶，方玉江

1.湘南學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤防治中心，湖南 郴州 423000；

2. 美國(guó)密蘇里大學(xué)醫(yī)學(xué)院Ellis Fischel腫瘤中心，密蘇里州 哥倫比亞 65212

胰腺癌是一種臨床表現(xiàn)隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤，由于胰腺癌早期癥狀隱匿，診斷困難，因而存活率極低［1］?；熓瞧渲匾闹委煼椒?，然而至今單純的化療并沒有給患者帶來(lái)明顯的生存獲益。更為遺憾的是，至今還未找到在胰腺癌對(duì)化療藥物耐受機(jī)制中起重要作用的耐受基因。一般認(rèn)為，化療無(wú)效是由于凋亡受體或凋亡相關(guān)蛋白發(fā)生改變，使凋亡信號(hào)不能順利繼續(xù)傳遞所致［2-3］。因此，我們?cè)谝认侔┘?xì)胞中尋找能夠影響其凋亡通道信號(hào)順利傳遞的基因，通過基因敲除減少該基因?qū)Φ蛲鐾ǖ赖挠绊?，以期達(dá)到提高胰腺癌治療效果的目的。

Fas是廣泛存在于正常細(xì)胞和腫瘤表面的Ⅰ型跨膜蛋白，F(xiàn)as配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)是Fas的天然配體，屬于Ⅱ型膜蛋白。在部分惡性腫瘤細(xì)胞中FasL與Fas的結(jié)合產(chǎn)生的死亡信號(hào)是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，誘騙受體-3(decoy receptor 3，DcR3)是Pitti等［4］在1998年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種分泌型的可溶性的蛋白分子，在它的氨基酸序列中缺少明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，其配體包括FasL、LIGHT和LTβR。有研究發(fā)現(xiàn)，DcR3通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制Fas和FasL的結(jié)合，以及阻斷LIGHT和LTβR及HVEM/TR2的相互作用，從而阻斷FasL和LIGHT介導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸密切相關(guān)［5-7］。本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默DcR3，旨在觀察DcR3-siRNA對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡和化療敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞株

HiPerFect Transfection Reagent試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Techne公司，DcR3、β-actin、Caspase-8和Caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，F(xiàn)asL抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，核蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，堿性磷酸酶共軛抗兔及抗鼠IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，Annexin-Ⅴ/PI凋亡檢測(cè)試劑盒和流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，注射用吉西他濱購(gòu)自美國(guó)Eli Lilly公司(批準(zhǔn)文號(hào)：H20110535)；人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1由美國(guó)密蘇里大學(xué)醫(yī)學(xué)院Ellis Fischel腫瘤中心方玉江教授惠贈(zèng)。

1.2 DcR3-siRNA的構(gòu)建

應(yīng)用篩選siRNA的軟件，選取DcR3靶序列為5’-CGCUGCAGCCUCUUGAU GGAGAUGUCC-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成DcR3特異性siRNA序列。正義鏈序列：5’-ACACCCACCUACCC CUGGCTT-3’；反義鏈序列：5’-GCCAGGGGU AGGUGGGUGUTT-3’。同時(shí)將上述寡核苷酸序列打亂重新組合，設(shè)計(jì)5’-GACACACCACCU CCCCUGCTT-3’和5’-GGCGACGGGUGUGA GGUGUTT-3’作為陰性對(duì)照。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1培養(yǎng)條件為：含10%小牛血清PRMI-1640培養(yǎng)基(內(nèi)含100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 基因轉(zhuǎn)染

按照HiPerFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。用胰酶消化細(xì)胞后，接種于6孔板上，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞每孔達(dá)到30%～50%。用Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基將已經(jīng)構(gòu)建的DcR3-siRNA稀釋至100 nmol/L，混合均勻后加入HiPerFect，混合均勻后加入培養(yǎng)孔中。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后可進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)。同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(control組)和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒對(duì)照組(mock組)。

1.5 ELISA實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。首先用濃度100 μL/孔的抗DcR3單克隆抗體包被ELISA板，置于37 ℃下4 h；再加入5%小牛血清置于37 ℃下封閉40 min，封閉時(shí)將封閉液加滿各反應(yīng)孔，封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min；將稀釋好的DcR3純標(biāo)品和待測(cè)樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，每樣品至少加雙孔，每孔100 μL，置于37 ℃下40～60 min，用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min；最后將生物素標(biāo)記的抗DcR3抗體加入板中，室溫溫育1 h，每孔加入底物TMB 100 μL置于37 ℃條件下避光放置10 min，加入終止液顯色，用酶標(biāo)儀于492 nm處測(cè)定吸光度(D)值。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期未轉(zhuǎn)染的AsPC-1細(xì)胞、轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的AsPC-1細(xì)胞及轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA的AsPC-1細(xì)胞，分別接種于96孔培養(yǎng)板上，每5孔為1復(fù)孔，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后分別加入不同濃度的吉西他濱(0、0.01、0.1、1、10和100 μg/mL)，設(shè)空白對(duì)照，加入等量培養(yǎng)基；72 h后加入5 mg/mL的MTT試劑10 μL；4 h后移去上清液，加入DMSO溶解沉淀，30 min后用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定D值，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組D值/對(duì)照組D值)×100%，以橫座標(biāo)為藥物濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞存活曲線；計(jì)算IC50，IC50=lg-1［Xm-i(ΣP-0.5)］，其中，Xm為設(shè)計(jì)的最大濃度的對(duì)數(shù)值，i為各濃度倍比濃度的對(duì)數(shù)值，ΣP為各組生長(zhǎng)抑制率之和，0.5為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)［8］，重復(fù)4次，取平均值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)Annexin-Ⅴ/PI雙染色實(shí)驗(yàn)

取用濃度為10 μg/mL的吉西他濱處理48 h后的細(xì)胞用胰酶消化成懸液，收集細(xì)胞(5×105個(gè))，PBS清洗2次，1×結(jié)合緩沖液再洗1次，按照Annexin-Ⅴ/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，即每份細(xì)胞加入100 μL的Binding Buffer、3 μL Annexin-Ⅴ和3 μL PI，混勻，室溫、避光、反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)

收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑等體積混合，再加入DTT溶液，濃度為1 mmol/L)裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度后各組取200 μg蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE，通過電轉(zhuǎn)印法將蛋白從SDS上轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，加入一抗(DcR3和FasL為1∶1 000；Caspase-8和Caspase-3為1∶500；β-actin為1∶2 000)，于4 ℃下溫育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶連接的二抗(1∶2 000)室溫振蕩溫育1 h，最后NBT/BCIP顯影，以目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 RTFQ-PCR

用TRIzol提取各組細(xì)胞的總RNA，各取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μL cDNA以F a s L引物(上游5’-G G T T G C C T T G G TAGGATTGG-3’，下游5’-CCTTGAGTTG GACTTGCCTGTT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為196 bp)、Caspase-8引物(上游5’-TACTAC C G A A A C T T G G A C C-3’， 下 游5’-GTGAAAGTAGGTTGTGGC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為515 bp)、Caspase-3引物(上游5’-ATGGAGAACAATAAAACCT-3’，下游5’-CTAGTGATAAAAGTAGAGTTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為834 bp)及GAPDH引物(上游5’-TGACTTCAACAGCGACACCCAC-3’，下游5’-AACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為277 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別檢測(cè)各組中的FasL、Caspase-8、Caspase-3和內(nèi)參GAPDH的mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件為：94.0 ℃變性45 s；60.0 ℃(FasL)、50.6 ℃(Caspase-8)、50.0 ℃(Caspase-3)退火60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72.0 ℃延伸5 min。最后取擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，產(chǎn)物條帶用凝膠成像系統(tǒng)照相并進(jìn)行灰度分析，目的片段的相對(duì)表達(dá)量=目的基因的灰度值/GAPDH的灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，細(xì)胞存活率、抑制率及凋亡率用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后AsPC-1細(xì)胞中DcR3蛋白水平的變化

采用ELISA檢測(cè)DcR3蛋白量，結(jié)果顯示，DcR3-siRNA組的DcR3蛋白量明顯少于control組和mock組(P＜0.01，圖1A)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，DcR3-siRNA組中DcR3蛋白的表達(dá)水平明顯低于control組和mock組(P＜0.01，圖1B)。DcR3-siRNA對(duì)DcR3蛋白表達(dá)具有特異性的基因沉默效應(yīng)，其沉默的效率與ELISA結(jié)果一致。

圖 1 各組細(xì)胞中DcR3蛋白的表達(dá)Fig. 1 The expression of DcR3 protein in Aspc-1 cells

2.2 轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后AsPC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱化療敏感性的變化

應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AsPC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。結(jié)果顯示，control組、mock組和DcR3-siRNA組AsPC-1細(xì)胞的存活率隨著吉西他濱濃度增加而降低，DcR3-siRNA組AsPC-1細(xì)胞的存活率降低更顯著(圖2A)；DcR3-siRNA組AsPC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的IC50值為(0.21±0.02) μg/mL，mock組AsPC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的IC50值為(2.25±0.32) μg/mL，control組AsPC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的IC50值為(2.16±0.35) μg/mL。轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后，AsPC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性明顯增加，與mock組和control組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2B)。

2.3 吉西他濱處理后各組AsPC-1細(xì)胞凋亡的變化

流式結(jié)果顯示，10 μg/mL吉西他濱處理48 h后control組、siRNA(-)組和DcR3-siRNA組細(xì)胞凋亡率分別為11.2%±0.34%、11.5%±1.15%和54.1%±2.76%，DcR3-siRNA組凋亡率明顯高于control組和mock組(P＜0.05，圖3)，提示吉西他濱處理后的DcR3-siRNA組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象更加嚴(yán)重。

2.4 轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后各組細(xì)胞中FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白和mRNA表達(dá)的變化

Control組、mock組和DcR3-siRNA組細(xì)胞接受吉西他濱處理后，采用Western blot檢測(cè)各組FasL、Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，DcR3-siRNA組FasL、Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯高于其他各組，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4A、B、C)。RTFQ-PCR進(jìn)一步證實(shí)，轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后可以上調(diào)FasL、Caspase-8和Caspase-3 mRNA的表達(dá)(圖4D、E、F)，其上調(diào)的效應(yīng)與Western blot結(jié)果一致。

圖 2 不同濃度吉西他濱處理后各組細(xì)胞存活曲線和IC50Fig. 2 The cell viability and IC50 of different concentrations of gemcitabine after treatment

圖 3 吉西他濱處理后各組AsPC1細(xì)胞的凋亡情況Fig. 3 Apoptosis of AsPC1 cells in each group treated with gemcitabine

3 討 論

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，DcR3在胰腺癌中高表達(dá)，與胰腺癌化療敏感性密切相關(guān)［8-10］。Sung等［9］研究肺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，DcR3的高表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射的抵抗，當(dāng)敲除DcR3基因后，可以明顯增加腫瘤細(xì)胞凋亡，從而增加肺癌細(xì)胞的化療敏感性。Wang等［10］研究提示，沉默胰腺癌中DcR3高表達(dá)，可以增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。

本實(shí)驗(yàn)將DcR3-siRNA轉(zhuǎn)染至AsPC-1細(xì)胞后，通過藥物敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默DcR3基因組的AsPC-1細(xì)胞對(duì)放射的敏感性明顯要高于未沉默的細(xì)胞組?；熕幬锾幚砗螅聊珼cR3基因的AsPC-1細(xì)胞組凋亡率明顯高于未沉默組的細(xì)胞凋亡率。提示沉默DcR3基因后可以促進(jìn)化療誘導(dǎo)的凋亡而增加人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的化療敏感性。

DcR3調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡是通過與FasL競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合而阻斷凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。FasL凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與Caspase的激活密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后AsPC-1細(xì)胞中的FasL、Caspase-8和Caspase-3都存在明顯的上調(diào)現(xiàn)象。Caspase-8基因是FasL途徑凋亡通路的啟動(dòng)基因，其下游就是Caspase-3基因，Caspase-3基因被認(rèn)為是FasL凋亡途徑的最終執(zhí)行者［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，DcR3-siRNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加細(xì)胞放射敏感性可能是通過激活FasL/Caspase途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖 4 轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后可激活FasL、Caspase-8和Caspase-3的表達(dá)Fig. 4 The expression of FasL, Caspase-8 and Caspase-3 after transfect DcR3-siRNA

本研究表明，RNA干擾沉默DcR3基因可以增加人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，可能是沉默DcR3基因可激活FasL/Caspase凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡所致。提示DcR3→FasL→Caspase通路在人胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性起著至關(guān)重要的作用，有望成為人胰腺癌細(xì)胞基因治療新的靶點(diǎn)之一。

［1］ 倪泉興, 虞先濬, 劉 亮. 中國(guó)胰腺癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的探討［J］. 中國(guó)癌癥雜志, 2012, 22(2): 81-87.

［2］ WU Z H, LIN C, LIU M M, et al. Src inhibition can synergize with gemcitabine and reverse resistance in triple negative breast cancer cells via the AKT/c-Jun pathway［J］. PLoS One, 2016 11(12): e0169230.

［3］ SAROSIEK K A, FRASER C, MUTHALAGU N, et al.Developmental regulation of mitochondrial apoptosis by c-Myc governs age- and tissue-specific sensitivity to cancer therapeutics ［J］. Cancer Cell, 2017, 31 (1): 142-156.

［4］ PITTI R M, MARSTERS S A, LAWRENCE D A, et al.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer［J］. Nature, 1998, 396(6712): 699-703.

［5］ ZHANG Y, LI D, ZHAO X, et al. Decoy receptor 3 suppresses FasL-induced apoptosis via ERK1/2 activation in pancreatic cancer cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2015,463(9): 1144-1151.

［6］ ZHOU J, SONG S, HE S, et al. Silencing of decoy receptor 3(DcR3) expression by siRNA in pancreatic carcinoma cells induces Fas ligand-mediated apoptosis in vivo and in vivo［J］. Int J Mol Med, 2013, 32(3): 653-660.

［7］ LIN W W, HSIEH S L. Decoy receptor 3: a pleiotropic immunomodulator and biomarker for inflammatory diseases,autoimmune diseases and cancer［J］. Biochem pharmacol,2011, 81(7): 838-847.

［8］ 蔣知儉主編. 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］. 北京: 人民衛(wèi)生出版社,1997: 138-140.

［9］ SUNG H Y, WU H G, AHN J H, et al. Dcr3 inhibit p53-dependent apoptosis in gamma-irradiated lung cancer cells［J］. Int J Radiat Biol Cancer, 2010, 86(9): 780-790.

［10］ WANG X, ZHANG M, SUN W, et al. Reduction of decoy receptor 3 enhances TRAIL-mediated apoptosis in pancreatic cancer ［J］. PLOS One, 2013, 8(10): e74272.

［11］ YUAN J, NAJAFOV A, PY B F. Roles of Caspases in necrotic cell death［J］. Cell, 2016, 167(7): 1693-1704.