劉玉珍，張夢雪，呂世軍，鄭 潔

濰坊醫(yī)學院臨床病理系，神經(jīng)疾病與再生修復實驗室，山東 濰坊 261053

LASP1最初是從乳腺癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(metastatic axillary lymph nodes，MLN)cDNA文庫中篩選克隆得到的，又名MLN50，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的肌動蛋白結合蛋白和斑黏蛋白支架蛋白［1］，通過與肌動蛋白結合，參與細胞骨架的重組調(diào)控及細胞遷移。目前多項研究發(fā)現(xiàn)，LASP1在前列腺癌、膽囊癌、非小細胞肺癌、結直腸癌、口腔癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中的表達明顯升高，并與多種腫瘤的增殖和侵襲相關［2-7］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，LASP1在胃癌腫瘤組織中高表達，且與腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及浸潤深度相關［8］，但LASP1在胃癌細胞株BGC823中的功能目前尚不清楚。本研究應用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術下調(diào)胃癌細胞株BGC823中LASP1的表達，并在體外實驗中觀察腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的變化。為探討LASP1影響胃癌細胞的侵襲和運動能力的分子機制，本研究采用F-actin聚合實驗和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)實驗對轉(zhuǎn)染前后BGC823細胞F-actin的聚合能力和Akt磷酸化的情況進行了檢測，從而探討LASP1與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細胞株

胃癌細胞系(BGC823、SGC7901、MGC803和HGC27)和正常胃黏膜上皮GES-1細胞株購自美國ATCC公司。一抗LASP1購自美國Millipore公司，一抗Akt、p-Akt(Ser473)購自美國Cell Signaling公司，RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司，LipofectamineTM3000和TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本東洋紡績株式會社，實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR)試劑盒購自瑞士Roche公司，Cell-Light?EdU Apollo?488細胞增殖試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司，Transwell小室、細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，鬼筆環(huán)肽購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

L A S P 1 s i R N A購自上海吉凱基因化學技術有限公司，序列為：5’-AAGGTGAACTGTCTGGATAAG-3’，陰性對照(negative control，NC)siRNA序列為：5’-UATUCGCTTCGUUGACGCUAA-3’。將BGC823細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。將細胞分為3組：① siLASP1/BGC823細胞組，BGC823細胞瞬時轉(zhuǎn)染LASP1 siRNA；②NC組，BGC823細胞瞬時轉(zhuǎn)染NC siRNA；③ 空白對照組，BGC823細胞常規(guī)培養(yǎng)，不進行任何處理。轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。

1.3 RTFQ-PCR檢測LASP1 mRNA的表達

收集各個實驗組對數(shù)生長期的細胞，用TRIzol提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。取2 μL cDNA，總體系20 μL，以SYBR Green染料法進行RTFQ-PCR，GAPDH為內(nèi)參照。

1.4 Western blot檢測LASP1蛋白的表達

各實驗組細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，裂解細胞提取總蛋白，各組加等量蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜封閉后加入LASP1、Akt和p-Akt一抗(均為1∶1 000稀釋)，4 ℃溫育過夜，二抗溫育1 h，并以ECL化學發(fā)光法顯影、曝光。用Image J圖像處理軟件進行灰度分析。

1.5 細胞增殖實驗

采用Cell-Light? EdU Apollo?488細胞增殖試劑盒檢測。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，是檢測細胞增殖的標志物。取對數(shù)生長期的BGC823細胞鋪于96孔板中，轉(zhuǎn)染24 h后加入50 μmol/L EdU工作液，100 μL/孔，溫育3 h后按照試劑說明書進行操作。熒光顯微鏡拍照時，3個實驗組各孔在100倍視野下隨機取3個視野采集圖像。綠色熒光表示溫育EdU溶液3 h內(nèi)增殖的細胞，藍色熒光表示細胞總數(shù)。細胞增殖率=增殖細胞數(shù)/細胞總數(shù)，再進行t檢驗。

1.6 細胞遷移實驗

將轉(zhuǎn)染 24 h實驗組和對照組100 μL細胞懸液(1×106μL)加入Transwell小室上室，下室加600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，0.1%結晶紫染色15 min。在100倍視野下各取3個視野拍照，計數(shù)，計算平均值，重復3次并進行t檢驗。

1.7 細胞侵襲實驗

將Matrigel基質(zhì)膠與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶3比例稀釋，然后鋪在8 μm Transwell小室濾膜上面以覆蓋微孔，放入培養(yǎng)箱約2 h待其干燥。之后的實驗操作及統(tǒng)計分析同遷移實驗。

1.8 肌動蛋白聚合實驗

參照參考文獻［9］的實驗步驟進行操作，用與F-actin特異性結合的熒光染料鬼筆環(huán)肽染色，檢測F-actin聚合的變化。用下列公式計算F-actin的相對含量：刺激時間熒光值=刺激時間F-actin值/未刺激F-actin值。實驗重復3次，取作為實驗結果。

1.9 Akt磷酸化的檢測

將siLASP1/BGC823和NC組細胞用10 μg/L的表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)刺激10 min后，用冷PBS終止反應，裂解細胞提取蛋白做Western blot實驗，將所得結果進行分析。

1.10 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 LASP1 mRNA和蛋白在胃癌細胞中的表達

RTFQ-PCR結果顯示，LASP1基因在4株胃癌細胞中均有表達，且均高于在正常胃黏膜上皮GES-1細胞中的表達，其中BGC823和SGC7901表達相對較高(圖1)。因此，我們選擇BGC823細胞進行后續(xù)的體外實驗研究。

2.2 轉(zhuǎn)染LASP1 siRNA對胃癌細胞LASP1表達水平的影響

轉(zhuǎn)染后RTFQ-PCR檢測結果顯示，siRNA對BGC823細胞LASP1 mRNA和蛋白的表達有顯著的抑制作用(圖2)。

圖 1 LASP1 mRNA和蛋白在胃癌細胞株中的表達Fig. 1 Expression of LASP1 mRNA and protein in different gastric cancer cell lines

圖 2 轉(zhuǎn)染后 LASP1 mRNA和蛋白在胃癌細胞株BGC823中的表達Fig. 2 Expression of LASP1 mRNA and protein in BGC823 cell lines after transfection

2.3 LASP1抑制胃癌BGC823細胞的增殖

EdU細胞增殖實驗能快速直觀地檢測細胞復制活性，siLASP1/BGC823細胞組細胞的增殖率(0.307±0.010)低于NC組(0.374±0.015)及空白對照組(0.390±0.008)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示抑制LASP1的表達可降低BGC823細胞的增殖能力(圖3)。

2.4 LASP1抑制胃癌BGC823細胞的遷移

轉(zhuǎn)染LASP1 siRNA的BGC823細胞透過濾膜的數(shù)量(238.0±8.9)明顯低于NC組(308.0±6.7)及空白對照組細胞(335.0±9.6)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示LASP1的表達降低可抑制BGC823細胞的遷移能力(圖4)。

圖 3 EdU實驗檢測LASP1對BGC823細胞增殖的影響Fig. 3 Effect of LASP1 on cell proliferation in BGC823 cell lines using EdU assay

圖 4 Transwell小室實驗檢測LASP1對BGC823細胞遷移和侵襲的影響Fig. 4 Inf l uence of LASP1 on cell migration and invasion in BGC823 cell lines by transwell assay

2.5 LASP1抑制胃癌BGC823細胞的侵襲

轉(zhuǎn)染LASP1 siRNA的BGC823細胞透過Matrigel基質(zhì)膠和濾膜的數(shù)量(157.0±7.2)明顯低于NC(245.0±8.7)及空白對照組細胞(250.0±6.4)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示LASP1的低表達可抑制BGC823細胞的侵襲能力(圖4)。

2.6 F-actin聚合實驗

F-actin聚合實驗結果顯示，LASP1 siRNA轉(zhuǎn)染后的BGC823細胞在15～120 s時細胞內(nèi)肌動蛋白聚合量比對照組細胞明顯減少(圖5)。

2.7 Akt磷酸化的檢測

為研究LASP1在胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用的信號通路，本實驗采用10 μg/L EGF無血清培養(yǎng)基分別刺激各組細胞10 min。結果顯示，EGF刺激后，NC組Akt的磷酸化增強；而siLASP1/BGC823細胞組中Akt的磷酸化明顯受到抑制(圖6)。

圖 5 F-actin聚合實驗檢測BGC823細胞在不同時間的F-actin聚合量Fig. 5 Time course of relative F-actin content in BGC823 cells by F-actin polymerization assay

圖 6 Western blot檢測BGC823轉(zhuǎn)染后在EGF刺激下Akt的磷酸化結果Fig. 6 Western blot analysis of the Akt phosphorylation induced by EGF in transfected BGC823 cells

3 討 論

LASP1基因染色體定位于17q11～q21.3，所編碼蛋白由261個氨基酸組成。LASP1蛋白N末端的LIM結構域可與CXCR2等趨化因子受體結合，在細胞的趨化運動中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。與LIM結構域相鄰有R1和R2兩段伴肌動蛋白樣的重復序列，R1和R2序列介導LASP1與肌動蛋白F-actin和黏著斑蛋白Krp1結合，從而參與細胞偽足延伸和運動的調(diào)節(jié)。LASP1蛋白C末端的SH3結構域為富含脯氨酸的序列，能與細胞骨架蛋白Palladin、LPP、血管擴張刺激磷蛋白(VASP)和斑聯(lián)蛋白Zyxin等蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)細胞偽足形成、延伸和侵襲運動［9-10］。

已有研究發(fā)現(xiàn)，LASP1蛋白在前列腺癌、膽囊癌、非小細胞肺癌、結直腸癌、口腔癌及乳腺癌等腫瘤中高表達，并與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關。Li等［3］通過siRNA沉默膽囊癌細胞株中LASP1的表達后發(fā)現(xiàn)，細胞增殖、侵襲和遷移能力降低，細胞周期被阻滯在G2/M期，進一步進行機制研究發(fā)現(xiàn)，LASP1是通過調(diào)節(jié)S100P的表達，參與PI3K/AKT信號通路，從而調(diào)節(jié)細胞的運動能力。Grunewald等［7］研究發(fā)現(xiàn)，LASP1在乳腺癌組織中過表達，且與腫瘤大小和淋巴結轉(zhuǎn)移相關。

本研究采用RNAi下調(diào)胃癌BGC823細胞中LASP1的表達，并應用RTFQ-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平上驗證了LASP1的低表達。細胞功能學研究顯示，下調(diào)LASP1的表達后，細胞增殖能力顯著下降，說明抑制LASP1的表達可以抑制胃癌細胞的生長。有研究表明，抑制LASP1的表達可使膽囊癌和口腔癌等多種腫瘤細胞的細胞周期被阻滯在G2/M期，從而抑制細胞的生長［3,6］。

腫瘤細胞的遷移和侵襲是轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟，細胞的遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的限速環(huán)節(jié)，而侵襲則是惡性腫瘤細胞從原發(fā)部位突破基底膜向周圍組織浸潤的過程，是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的前提和基礎。在本研究中，細胞遷移和浸潤實驗的結果均顯示，與陰性對照組和空白對照組比較，RNAi組穿膜進入Transwell小室下室的腫瘤細胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)，提示下調(diào)LASP1的表達可使胃癌BGC823細胞的運動能力顯著降低，說明LASP1在腫瘤晚期的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

對于LASP1影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，國內(nèi)外報道較少。LASP1蛋白在黏著斑、膜皺襞和片狀偽足等多個肌動蛋白組裝的部位集中，可與相應的骨架蛋白結合，參與細胞骨架和運動的調(diào)節(jié)。siRNA下調(diào)乳腺癌細胞中LASP1的表達后，可通過抑制腫瘤細胞內(nèi)肌動蛋白的形成和偽足的延伸來抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。趨化運動與細胞的侵襲能力密切相關，而F-actin聚合是細胞趨化運動的關鍵。本實驗結果顯示，siLASP1/BGC823細胞F-actin聚合明顯減少，說明胃癌BGC823細胞在干擾LASP1的表達后運動能力降低與F-actin聚合減少密切相關。Wang等［11］報道LASP1通過調(diào)控MAPK、PI3K/Akt和Smad信號通路介導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)發(fā)生，從而促進結直腸癌轉(zhuǎn)移。本實驗用EGF刺激各組細胞10 min，Western blot檢測結果顯示，siLASP1/BGC823細胞組中Akt的磷酸化明顯受抑制，提示LASP1在胃癌細胞中通過參與PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路而影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本實驗應用siRNA轉(zhuǎn)染胃癌BGC823細胞，抑制LASP1的表達后發(fā)現(xiàn)，BGC823細胞的增殖、遷移和侵襲能力均降低，并且可能是通過參與F-actin聚合和PI3K/AKT信號通路從而調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。LASP1可作為新的胃癌標志物和治療靶點。

［1］ TOMASETTO C, MOOG-LUTZ C, REGNIER C H, et al.LASP1 (MLN 50) defines a new LIM protein subfamily characterized by the association of LIM and SH3 domains［J］. FEBS Lett, 1995, 373(3): 245-249.

［2］ SUN W, GUO L, SHAO G, et al. Suppression of LASP1 attenuates the carcinogenesis of prostatic cancer cell lines:Key role of the NF-κB pathway［J］. Oncol Rep, 2017,37(1): 341-347.

［3］ LI Z, CHEN Y, WANG X, et al. LASP1 induces proliferation,metastasis and cell cycle arrest at the G2/M phase in gallbladder cancer by down-regulating S100P via the PI3K/AKT pathway［J］. Cancer Lett, 2016, 372(2): 239-250.

［4］ ZHENG J, WANG F, LU S, et al. LASP1, regulated by miR-203, promotes tumor proliferation and aggressiveness in human non-small cell lung cancer［J］. Exp Mol Pathol,2016, 100(1): 116-124.

［5］ NIU Y, SHAO Z, WANG H, et al. LASP1-S100A11 axis promotes colorectal cancer aggressiveness by modulating TGFβ/Smad signaling［J］. Sci Rep, 2016, 6: 26112.

［6］ SHIMIZU F, SHIIBA M, OGAWARA K, et al. Overexpression of LIM and SH3 Protein 1 leading to accelerated G2/M phase transition contributes to enhanced tumourigenesis in oral cancer［J］. PLoS One, 2013, 8(12): e83187.

［7］ GRUNEWALD T G, KAMMERER U, SCHULZE E, et al.Silencing of LASP1 influences zyxin localization, inhibits proliferation and reduces migration in breast cancer cells［J］. Exp Cell Res, 2006, 312(7): 974-982.

［8］ ZHENG J, YU S, QIAO Y, et al. LASP1 promotes tumor proliferation and metastasis and is an independent unfavorable prognostic factor in gastric cancer［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2014, 140(11): 1891-1899.

［9］ LU S, NIU N, GUO H, et al. ARK5 promotes glioma cell invasion, and its elevated expression is correlated with poor clinical outcome［J］. Eur J Cancer, 2013, 49(3): 752-763.

［10］ LI B, ZHUANG L, TRUEB B. Zyxin interacts with the SH3 domains of the cytoskeletal proteins LIM-nebulette and LASP1［J］. Biol Chem, 2004, 279(19): 20401-20410.

［11］ WANG H, SHI J, LUO Y, et al. LIM and SH3 protein 1 induces TGFβ-mediated epithelial-mesenchymal transition in human colorectal cancer by regulating S100A4 expression［J］. Clin Cancer Res, 2014, 20(22): 5835-5847.