程凌霄，劉 敏，靳雨辰，陳立波

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200233

甲狀腺癌是最常見的惡性內(nèi)分泌腫瘤，其中分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)占全部甲狀腺癌的90%［1］。大多數(shù)腫瘤呈相對(duì)惰性，經(jīng)過手術(shù)、131I消融及TSH替代/抑制治療，疾病可治愈。然而，近5%的DTC發(fā)生失分化，伴隨一系列碘代謝相關(guān)基因的沉默、腫瘤細(xì)胞攝碘率的下降，最終導(dǎo)致131I治療的失?。?-3］。這些放射性碘難治性分化型甲狀腺癌(radioiodine refractory differentiated thyroid carcinoma，RR-DTC)常進(jìn)展迅速，伴多處轉(zhuǎn)移，是甲狀腺癌致死的主要原因［2］。

RR-DTC病灶在18F-FDG PET-CT檢查中常呈陽性，這是失分化的甲狀腺癌細(xì)胞GLUT1等糖代謝相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)、糖代謝活躍所致［3-5］。甲狀腺癌的失分化、碘代謝相關(guān)基因沉默與MAPK通路的激活相關(guān)，而MAPK通路的激活是BRAFV600E所致［4］。我們之前的研究已經(jīng)證實(shí)，MAPK抑制劑(索拉非尼和卡博替尼)可使甲狀腺癌細(xì)胞再分化，在提高其攝碘率的同時(shí)降低細(xì)胞GLUT1表達(dá)水平［6］。其他類似的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，BRAF/MEK抑制劑可通過抑制甲狀腺癌細(xì)胞中異常激活的MAPK通路提高甲狀腺癌攝碘率，表現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景［6-8］。然而，相關(guān)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，司美替尼和達(dá)拉非尼只能使部分RR-DTC患者腫瘤攝碘提高。部分患者腫瘤攝碘量并未達(dá)到治療劑量閾值，其中的具體機(jī)制尚未明確［9-10］。

MAPK通路的激活所致鈉-碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium-iodide symporter，NIS)基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白去乙?；荖IS基因沉默的重要機(jī)制之一［11］。包括帕比司他在內(nèi)的多種組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)都被發(fā)現(xiàn)可以增加甲狀腺癌細(xì)胞中NIS的表達(dá)，提高攝碘率［12-14］。據(jù)此推測(cè)，BRAF/MEK抑制劑聯(lián)合HDACI可能具有協(xié)同再分化作用，能較單藥更顯著地提高攝碘率。

本研究將觀察上述聯(lián)合再分化策略能否較單獨(dú)應(yīng)用獲得更強(qiáng)的再分化作用，從而進(jìn)一步提高細(xì)胞的攝碘能力并產(chǎn)生更強(qiáng)的放射性碘毒性。同時(shí)，我們還將評(píng)估各種再分化方案下細(xì)胞GLUT的表達(dá)及葡萄糖代謝的變化，進(jìn)一步揭示18F-FDG PET-CT在評(píng)估再分化療效方面的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物

本研究所用細(xì)胞系均為乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)細(xì)胞。BCPAP細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，K1細(xì)胞系由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所惠贈(zèng)，BHP 2-7細(xì)胞系由Jerome M. Hershman教授惠贈(zèng)。

細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中。各項(xiàng)試驗(yàn)中，細(xì)胞分別用達(dá)拉非尼、司美替尼、帕比司他單獨(dú)或達(dá)拉非尼與帕比司他聯(lián)合、司美替尼與帕比司他聯(lián)合處理一定時(shí)間，并用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)處理組作為對(duì)照。

1.2 突變檢測(cè)及細(xì)胞增殖試驗(yàn)

用RNeasy Kit(購自德國Qiagen公司)提取細(xì)胞總RNA送檢。將3種細(xì)胞用藥物處理24、48和72 h后，用Cell Counting Kit-8(購自日本同仁化學(xué)研究所)檢測(cè)，使用GraphPad Prism 5.0計(jì)算IC50。

1.3 細(xì)胞周期測(cè)試

接種3.0×105個(gè)細(xì)胞于25 cm2培養(yǎng)瓶中，過夜，達(dá)拉非尼(0.1 μmol/L)、司美替尼(2.5 μmol/ L)、帕比司他(0.05 μmol/L)單獨(dú)或達(dá)拉非尼(0.1 μmol/L)與帕比司他(0.05 μmol/ L)聯(lián)合、司美替尼(2.5 μmol/L)與帕比司他(0.05 μmol/L)聯(lián)合溫育24 h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)

接種3.0×105個(gè)細(xì)胞于25 cm2培養(yǎng)瓶中，過夜，達(dá)拉非尼(0.1 μmol/L)、司美替尼(2.5 μmol/ L)、帕比司他(0.05 μmol/L)單獨(dú)或達(dá)拉非尼(0.1 μmol/L)與帕比司他(0.05 μmol/ L)聯(lián)合、司美替尼(2.5 μmol/L)與帕比司他(0.05 μmol/L)聯(lián)合作用48 h后提取細(xì)胞總RNA。使用QuantiTect Reverse Transcription Kit(購自德國Qiagen公司)由RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)錄得cDNA。最后，在ABI Prism 7900HT Sequence Detector上進(jìn)行RTFQ-PCR分析，所用試劑盒SYBR Green MasterMix購自德國Qiagen公司。本實(shí)驗(yàn)用18S作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)

培養(yǎng)的細(xì)胞用相應(yīng)藥物處理48 h后，用RIPA裂解細(xì)胞，12 000×g離心10 min，變性。將蛋白樣品電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后一抗4度溫育16 h，二抗室溫溫育1.5 h，最后曝光檢測(cè)。本試驗(yàn)所用一抗來源包括：Cell Signaling Technology(p-Erk1/2、Erk1/2、Ac-Histone H3和Histone H3)和Protein tech(NIS、Tg、TPO、TSHR、GLUT1和GLUT3)。

1.6 碘攝取實(shí)驗(yàn)

接種1.5×105個(gè)細(xì)胞于6孔板上，分別用達(dá)拉非尼、司美替尼、帕比司他單獨(dú)或達(dá)拉非尼與帕比司他聯(lián)合、司美替尼與帕比司他聯(lián)合處理細(xì)胞48 h。進(jìn)行碘攝取實(shí)驗(yàn)時(shí)，每組3孔，1孔用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，另2孔用含2 μCi NaI的無血清培養(yǎng)基于37 ℃下溫育1 h(其中1孔作為對(duì)照用300 μmol/L NaClO4預(yù)處理30 min)。棄去液體，在冰上將細(xì)胞用0.3 mol/L NaOH溶液裂解后用伽瑪計(jì)數(shù)器測(cè)得細(xì)胞內(nèi)125I計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)

采用本課題組以往方法［15］，接種4×102個(gè)細(xì)胞于6孔板上，貼壁48 h。此后，加藥培養(yǎng)48 h，PBS洗滌，然后實(shí)驗(yàn)組每孔細(xì)胞用含20 μCi NaI的1 mL完全培養(yǎng)基溫育6 h。隨后棄去含NaI的培養(yǎng)基，洗滌，并用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 d。最后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后觀察克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。RTFQ-PCR、放射性碘攝取和流出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因突變檢測(cè)

BCPAP細(xì)胞具有BRAFV600E突變及野生型NRAS基因。K1細(xì)胞具有BRAFV600E、PIK3CA突變及野生型NRAS基因。BHP2-7細(xì)胞具有RET/PTC1重排，其BRAF、NRAS基因?yàn)橐吧汀?/p>

2.2 再分化藥物對(duì)細(xì)胞增殖和周期的影響

BCPAP細(xì)胞、K1細(xì)胞及BHP2-7細(xì)胞中達(dá)拉非尼的IC50分別為232、146和315 nmol/ L，司美替尼的IC50分別為9 274、16 270和23 370 nmol/L，帕比司他的IC50分別為62、148和64 nmol/L。當(dāng)與0.05 μmol/L帕比司他聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)，達(dá)拉非尼的IC50降低到64、31和148 nmol/L，司美替尼的IC50降低到1 800、1 022和4 382 nmol/L。

對(duì)照組BCPAP細(xì)胞52.8%處于G1期，6.9%處于S期，40.3%處于G2期。BCPAP細(xì)胞經(jīng)MAPK抑制劑或帕比司他處理24 h后，G1期細(xì)胞均較對(duì)照組明顯增多(P＜0.01)；用MAPK抑制劑聯(lián)合帕比司他作用于BCPAP細(xì)胞，G1期細(xì)胞均較單藥組增多(圖1)。

2.3 碘和糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)

達(dá)拉非尼或司美替尼作用細(xì)胞48 h后，BCPAP和K1細(xì)胞的碘代謝相關(guān)基因(NIS、Tg、TPO及TSHR)的mRNA表達(dá)量有所增加，GLUT1基因的mRNA表達(dá)量有所減少，而GLUT3基因的表達(dá)水平無明顯變化。BHP2-7細(xì)胞在2種MAPK抑制劑作用下，碘代謝相關(guān)基因表達(dá)并未出現(xiàn)明顯變化。將MAPK抑制劑和帕比司他聯(lián)用后，BCPAP和K1細(xì)胞碘代謝相關(guān)基因表達(dá)顯著增加，GLUT1基因表達(dá)顯著減少(圖2)。

0.1 μmol/L達(dá)拉非尼抑制BCPAP和K1細(xì)胞p-ERK的表達(dá)(圖3)。0.05 μmol/L帕比司他可使3種細(xì)胞乙酰化組蛋白H3表達(dá)量增加。

2.4 放射性碘攝取

達(dá)拉非尼、司美替尼、帕比司他處理組BCPAP和K1細(xì)胞放射性碘攝取均高于對(duì)照組(P＜0.05，圖4)。BCPAP和K1細(xì)胞在MAPK抑制劑和帕比司他聯(lián)合處理后，攝碘率較單藥作用均進(jìn)一步提高(P＜0.05)。BHP 2-7在MAPK抑制劑作用下攝碘率并未見提高(P＞0.05)；帕比司他單獨(dú)或聯(lián)合MAPK抑制劑時(shí)攝碘率均有所提高(P＜0.05)。所有藥物提高攝碘率的作用均會(huì)被NaClO4阻斷。

圖 1 達(dá)拉非尼、司美替尼、帕比司他單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)BCPAP細(xì)胞周期的影響Fig. 1 Inf l uence of dabrafenib, selumetinib and panobinostat alone or in combinition on cell cycle of BCPAP cells

圖 2 達(dá)拉非尼、司美替尼、帕比司他單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)PTC細(xì)胞碘糖代謝基因mRNA表達(dá)量的影響Fig. 2 Inf l unce of dabrafenib, selumetinib and panobinostat alone or in combinition on mRNA level of iodine and glucose handling genes in PTC cells

圖 3 達(dá)拉非尼、帕比司他單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)PTC細(xì)胞p-ERK及Ac-Histone表達(dá)量的影響Fig. 3 Inf l unce of dabrafenib and panobinostat alone or in combinition on p-ERK and Ac-Histone level in PTC cells

圖 4 達(dá)拉非尼、司美替尼、帕比司他單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)PTC細(xì)胞攝碘能力的影響Fig. 4 Inf l unce of dabrafenib, selumetinib and panobinostat alone or in combinition on radioiodine uptake in PTC cells

2.5 131I毒性實(shí)驗(yàn)

經(jīng)達(dá)拉非尼、司美替尼或帕比司他單藥并用131I處理組的BCPAP細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于對(duì)照組(P＜0.05)。MAPK抑制劑、帕比司他、131I聯(lián)合處理組的BCPAP細(xì)胞克隆數(shù)較單藥處理組更少(P＜0.05，圖5)。

圖 5 達(dá)拉非尼、司美替尼、帕比司他單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)BCPAP細(xì)胞131I細(xì)胞毒性作用的影響Fig. 5 Inf l unce of dabrafenib, selumetinib and panobinostat alone or in combinition on 131I toxity in BCPAP cells

3 討 論

MAPK通路的激活等因素所致的NIS等碘代謝相關(guān)基因的沉默通常導(dǎo)致甲狀腺癌出現(xiàn)放射性碘抵抗［4］。相比BRAF/MEK抑制劑，多激酶抑制劑的患者耐受較差，故而BRAF/MEK特異性抑制劑成為誘導(dǎo)RR-DTC再分化并介導(dǎo)131I治療的較佳選擇［16-18］。然而，在小樣本臨床試驗(yàn)中，BRAF/MEK抑制劑誘導(dǎo)再分化的有效率并不太高，其原因尚不明確，提高上述MAPK抑制劑誘導(dǎo)再分化效能的研究十分必要［9-10］。

帕比司他是一種新型HDACI，以往的體外實(shí)驗(yàn)顯示，其可以提高分化型甲狀腺癌NIS蛋白表達(dá)水平及攝碘能力［14］。本研究中，對(duì)于攜帶BRAFV600E突變的PTC細(xì)胞，用帕比司他與MAPK抑制劑聯(lián)合作用后，其碘代謝相關(guān)基因表達(dá)較單藥處理進(jìn)一步提高，細(xì)胞膜上NIS蛋白表達(dá)更多，攝碘率進(jìn)一步提高，放射性碘對(duì)細(xì)胞毒性作用也比單一用藥更加明顯。兩類藥物協(xié)同再分化作用的原因可能是，NIS啟動(dòng)子區(qū)組蛋白去乙?；瘜?dǎo)致其沉默，而BRAFV600E突變所致MAPK通路激活可導(dǎo)致NIS啟動(dòng)子區(qū)組蛋白去乙?；?，因而MAPK抑制劑和HDACI聯(lián)合，可以強(qiáng)有力地抑制NIS啟動(dòng)子區(qū)組蛋白去乙?；?，從而顯著提高NIS表達(dá)水平［11］。

甲狀腺癌細(xì)胞的碘和糖代謝之間存在“蹺蹺板”效應(yīng)［5］。隨著腫瘤細(xì)胞的失分化，碘代謝相關(guān)基因下調(diào)，GLUT1表達(dá)上調(diào)，故而低分化甲狀腺癌細(xì)胞攝取18F-FDG能力提高［3,5］。在我們此前的研究中，BHP2-7細(xì)胞經(jīng)多激酶抑制劑再分化治療后，GLUT1、GLUT3表達(dá)和18F-FDG攝取率降低［6］；HDACI也曾被發(fā)現(xiàn)可以降低肺癌細(xì)胞GLUT1的表達(dá)［19］。與之相似地，本研究中的APK抑制劑和HDACI均可降低GLUT1表達(dá)，這為用18F-FDG PET/CT預(yù)測(cè)再分化治療效果提供了理論基礎(chǔ)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)達(dá)拉非尼抑制腫瘤生長及誘導(dǎo)再分化的作用具有選擇性，即對(duì)攜帶BRAFV600E突變的BCPAP和K1細(xì)胞作用明顯，而對(duì)不含BRAFV600E突變的BHP 2-7細(xì)胞無顯著作用。這一現(xiàn)象與之前一些研究中BRAF抑制劑的BRAFV600E突變依賴性類似［20-21］。本研究中司美替尼的作用也具有選擇性，BHP 2-7細(xì)胞療效較差，可能是因?yàn)樵摷?xì)胞系中雖然MAPK通路被抑制，激活的PI3K/AKT通路依然對(duì)腫瘤細(xì)胞生長與代謝影響產(chǎn)生重要影響［22］。該發(fā)現(xiàn)可能會(huì)為未來甲狀腺癌的精準(zhǔn)再分化治療奠定基礎(chǔ)。

［1］ KITAHARA C M, SOSA J A. The changing incidence of thyroid cancer［J］. Nat Rev Endocrinol, 2016, 12(11): 646-653.

［2］ SCOTT E, LEAROYD D, CLIFTON-BLIGH R J. Therapeutic options in papillary thyroid carcinoma: current guidelines and future perspectives［J］. Future Oncol, 2016, 12(22): 2603-2613.

［3］ KIM S, CHUNG J K, MIN H S, et al. Expression patterns of glucose transporter-1 gene and thyroid specific genes in human papillary thyroid carcinoma［J］. Nucl Med Mol Imaging, 2014, 48(2): 91-97.

［4］ VAISMAN F, CARVALHO D P, VAISMAN M. A new appraisal of iodine refractory thyroid cancer［J］. Endocr Relat Cancer, 2015, 22(6): R301-R310.

［5］ GRABELLUS F, NAGARAJAH J, BOCKISCH A, et al.Glucose transporter 1 expression, tumor proliferation, and iodine/glucose uptake in thyroid cancer with emphasis on poorly differentiated thyroid carcinoma［J］. Clin Nucl Med,2012, 37(2): 121-127.

［6］ RUAN M, LIU M, DONG Q, et al. Iodide- and glucosehandling gene expression regulated by sorafenib or cabozantinib in papillary thyroid cancer［J］. J Clin Endocrinol Metab, 2015, 100(5): 1771-1779.

［7］ HOU P, BOJDANI E, XING M. Induction of thyroid gene expression and radioiodine uptake in thyroid cancer cells by targeting major signaling pathways［J］. J Clin Endocrinol Metab, 2010, 95(2): 820-828.

［8］ CHAKRAVARTY D, SANTOS E, RYDER M, et al. Smallmolecule MAPK inhibitors restore radioiodine incorporation in mouse thyroid cancers with conditional BRAF activation［J］.J Clin Invest, 2011, 121(12): 4700-4711.

［9］ HO A L, GREWAL R K, LEBOEUF R, et al. Selumetinibenhanced radioiodine uptake in advanced thyroid cancer［J］.N Engl J Med, 2013, 368(7): 623-632.

［10］ ROTHENBERG S M, DANIELS G H, WIRTH L J.Redifferentiation of iodine-refractory BRAF V600E-mutant metastatic papillary thyroid cancer with dabrafenib-response［J］. Clin Cancer Res, 2015, 21(24): 5640-5641.

［11］ ZHANG Z, LIU D, MURUGAN A K, et al. Histone deacetylation of NIS promoter underlies BRAF V600E-promoted NIS silencing in thyroid cancer［J］. Endocr Relat Cancer, 2014, 21(2): 161-173.

［12］ KELLY W K, O’CONNOR O A, KRUG L M, et al. Phase Ⅰstudy of an oral histone deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid, in patients with advanced cancer［J］. J Clin Oncol, 2005, 23(17): 3923-3931.

［13］ SHERMAN E J, SU Y B, LYALL A, et al. Evaluation of romidepsin for clinical activity and radioactive iodine reuptake in radioactive iodine-refractory thyroid carcinoma［J］.Thyroid, 2013, 23(5): 593-599.

［14］ PUGLIESE M, FORTUNATI N, GERMANO A, et al. Histone deacetylase inhibition affects sodium iodide symporter expression and induces131I cytotoxicity in anaplastic thyroid cancer cells［J］. Thyroid, 2013, 23(7): 838-846.

［15］ CHEN L, ALTMANN A, MIER W, et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene［J］. J Nucl Med, 2006, 47(5): 854-862.

［16］ CABANILLAS M E, PATEL A, DANYSH B P, et al. BRAF inhibitors: experience in thyroid cancer and general review of toxicity［J］. Horm Cancer, 2015, 6(1): 21-36.

［17］ DADU R, DEVINE C, HERNANDEZ M, et al. Role of salvage targeted therapy in differentiated thyroid cancer patients who failed first-line sorafenib［J］. J Clin Endocrinol Metab,2014, 99(6): 2086-2094.

［18］ THOMAS L, LAI S Y, DONG W, et al. Sorafenib in metastatic thyroid cancer: a systematic review［J］. Oncologist, 2014,19(3): 251-258.

［19］ AMOêDO N D, RODRIGUES M F, PEZZUTO P, et al. Energy metabolism in H460 lung cancer cells: effects of histone deacetylase inhibitors［J］. PLoS One, 2011, 6(7): e22264.

［20］ XING J, LIU R, XING M, et al. The BRAF T1799A mutation confers sensitivity of thyroid cancer cells to the BRAF V600E inhibitor PLX4032 (RG7204) ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 404(4): 958-962.

［21］ SALERNO P, DE FALCO V, TAMBURRINO A, et al.Cytostatic activity of adenosine triphosphate-competitive kinase inhibitors in BRAF mutant thyroid carcinoma cells［J］. J Clin Endocrinol Metab, 2010, 95(1): 450-455.

［22］ MANFREDI G I, DICITORE A, GAUDENZI G, et al. PI3K/Akt/mTOR signaling in medullary thyroid cancer: a promising molecular target for cancer therapy［J］. Endocrine, 2015,48(2): 363-370.