蔡迪睿 臧旭東

摘要本實驗選擇公共衛(wèi)生間馬桶墊及洗手盆表面隨機樣本，進行表面微生物污染的檢測。采集樣本后，進行細菌分離、純化培養(yǎng)，形態(tài)學觀察，記錄細菌顏色、形態(tài)、大小與數量；將細菌進行16SrDNA檢測，測定細菌DNA序列并在NCBI上查出細菌種類。最后整理數據，得到馬桶墊上的細菌個數、種類，并分析微生物污染情況及其對人們健康的影響。

關鍵詞微生物污染 16SrDNA檢測 公共衛(wèi)生

微生物污染是主要傳染性疾病的源頭，包含食品微生物污染、空氣微生物污染、水體微生物污染等方面。在日常生活、工作環(huán)境中存在在著種類繁多、數量巨大的微生物。它們無處不在，而人們光憑肉眼無法看到，這就使得人們很容易忽視它們所造成的污染，對微生物污染的防范措施不夠系統(tǒng)，導致對生活環(huán)境及人類健康造成影響。探究不同環(huán)境下微生物的污染是目前探究環(huán)境污染的重要課題之一，了解工作、生活環(huán)境中衛(wèi)生物污染的現狀，對人們提高公共環(huán)境衛(wèi)生保護意識和減少傳染病的發(fā)生與傳播有著重大的意義。

1材料和方法

1.1樣品的采集

（1）采樣地點：武漢病毒研究所一號樓公共衛(wèi)生間馬桶墊、洗手盆。

（2）采樣方法：于50 mL離心管中放置10 mL質量分數為8.5%的生理鹽水；用5x5 cm的標準滅菌規(guī)格板放在被檢物體表面，用鑷子夾住浸有無菌生理鹽水液的脫脂棉，在規(guī)格板內橫豎往返各涂抹5次，并隨之轉動脫脂棉、連續(xù)采樣3個規(guī)格板面積；將脫脂棉于放入裝10 mL采樣液的試管中，蓋上蓋子，4～C保存。

1.2細菌的分離與純化

（1）移液器移取浸泡樣品生理鹽水100μL于LB固體培養(yǎng)基平板中，三角玻棒消毒后，將樣品在培養(yǎng)基表面上均勻涂布；倒置平板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后取出，計數。

（2）選擇不同形態(tài)的菌落進行劃線培養(yǎng)并記錄細菌群落的大小、形狀、表面與邊緣的模樣、顏色等。

（3）接種環(huán)挑取單菌落，交叉劃線法在新的LB平板上劃線，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后取出得到各個細菌的純培養(yǎng)物。

1.3細菌的16S rDNA序列鑒定

1.3.1實驗試劑

溶菌酶（20 mg/mL）、超純水、PCR mix（2xTS-INGKE MasterMix）、瓊脂糖、引物（表1）。

1.3.2實驗方法

1.3.2.1核酸提取

1.3.2.2基因擴增

（1）基因擴增體系見表2。

（2）基因擴增程序見表3。

（3）電泳檢測

稱取1g瓊脂糖置于100 mL TAE電泳緩沖液中，加熱融化，待溫度降至60℃左右時，均勻鋪板，制成1%的瓊脂糖凝膠。PCR反應結束后，加樣，以100V電壓進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，染色，用凝膠成像儀觀察，拍照，記錄實驗結果。

2實驗結果

2.1樣品的采集

本實驗共采集6份樣品（表4）。

2.2細菌的分離與純化

（1）對所采樣品分所得細菌總數進行統(tǒng)計，結果見表5。

（2）計算公式：細菌菌落總數（efu/100c㎡）（物體表面微生物污染）：物體表面菌落數=平皿上菌落的平均數×采樣液體稀釋倍數/采樣面積（c㎡）。

通過計算，得馬桶，洗手臺細菌數（表6）。

2.3細菌的16SrDNA序列鑒定

2.3.1部分電泳檢測結果

PCR部分檢測結果如圖1所示。

在實驗過程中，有一部分分離純化所得細菌并未檢測到16S rDNA片段，可能是未成功提取到基因組DNA的原因，后期可再提取DNA，重新擴增。

2.3.2測序統(tǒng)計結果

16S rDNA測序鑒定結果見表7。

由鑒定結果可知，在馬桶墊上，比較常見的菌屬為芽孢桿菌屬，其中部分細菌對人類健康有不同程度的危害。例如梭形芽孢桿菌可引起腹瀉，嚴重的會導致低白蛋白血癥，嬰幼兒等免疫力低下人群易感染患?。幌灅友挎邨U菌可引起嘔吐、腹瀉；雷氏普羅維登斯菌也是馬桶中的主要的細菌，雖然其引發(fā)的感染十分少見，但其可以引起敗血癥等嚴重的疾??；松鼠葡萄球菌，可以引起尿道感染、心內膜炎、腹膜炎等疾病。

洗手臺內，比較常見的細菌為蠟樣芽孢桿菌（可引起嘔吐、腹瀉），還有一些芽孢桿菌屬下其它的病原菌。相對于馬桶而言，洗手臺表面的病原菌數量少、致病性弱，但也存在大量引起嘔吐、腹瀉的蠟樣芽胞桿菌。

3討論

本次實驗是在病毒研究所一號大樓內進行，選取的采樣地點均是工作人員日常接觸最頻繁的區(qū)域。大樓內的衛(wèi)生間有定期的清潔和消毒，但從此次實驗的結果中可以看到，即便是清潔后的地方仍然會存在大量的細菌，其中還包含有不少病原菌。為了公眾的健康，預防各類傳染疾病，人們應該提高對公共區(qū)域清潔消毒工作的重視，創(chuàng)造一個潔凈衛(wèi)生的工作、生活環(huán)境。

任何地方都會存在著不同程度的微生物污染，它們對人類最大的影響就是會引發(fā)各種疾病，所以要做到時刻注意自己的衛(wèi)生與身體的健康狀況，盡最大可能防止微生物污染對身體的影響。