廖先清 周榮華 劉芳 張志剛 饒犇 陳偉 王開(kāi)梅

摘要：采用常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株，選育對(duì)亞洲玉米螟高毒力突變株。經(jīng)過(guò)4輪的ARTP誘變、鏡檢及搖瓶發(fā)酵篩選得到的突變株Bt-NBIC-380-18-407，其搖瓶發(fā)酵液對(duì)玉米螟二齡幼蟲(chóng)效價(jià)達(dá)到6 835 IU/μL，殺蟲(chóng)晶體蛋白含量6.3 mg/mL。該突變株的效價(jià)較初始菌株提高了25.7%，殺蟲(chóng)晶體蛋白含量提高了18.9%。經(jīng)過(guò)5次傳代，證實(shí)該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：常壓室溫等離子體（ARTP）誘變;蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380;亞洲玉米螟;殺蟲(chóng)晶體蛋白;生物效價(jià)

中圖分類(lèi)號(hào)：S476.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）21-0123-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.032? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Rapid Mutation Breeding of Highly Toxic Bacillus thuringiensis Strain Against Asian Corn Borer-by Atmospheric and Room Temperature Plasma

LIAO Xian-qing，ZHOU Rong-hua，LIU Fang，ZHANG Zhi-gang，RAO Ben，CHEN Wei，WANG Kai-mei

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/Biopesticide Subcenter of Hubei Science and Technology Innovation Center，

Wuhan 430064，China）

Abstract： A highly toxic Bacillus thuringiensis strain NBIC-380 against Asian corn borer was treated by atmospheric and room temperature plasma for improving the toxicity of the resulting mutants. Through 4 rounds of ARTP mutation and screening by microscopic checking，shake-flask fermentation and bioassay，one mutant designated as Bt-NBIC-380-18-407 with significant improvement of production of insecticidal crystal protein and potency-was obtained. The potency of the fermentation broth of the mutant against Asian corn borer larvae was increased 25.7% to 6 835 IU/μl，while the concentration of insecticidal crystal protein in fermentation broth was increased 18.9% to 6.3 mg/mL. The mutant showed rather good genetic stability after 5 times of consecutive transferring and cultivation.

Key words： ARTP mutagenesis; Bacillus thuringiensis; Asian corn borer;insecticidal crystal proteins; potency

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，形成芽孢的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有殺蟲(chóng)活性的伴孢晶體，對(duì)多種害蟲(chóng)具有特異殺蟲(chóng)活性，具有高效、安全及特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為目前開(kāi)發(fā)時(shí)間最長(zhǎng)、產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的生物殺蟲(chóng)劑[1]，廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)業(yè)、園藝、衛(wèi)生害蟲(chóng)等的防治，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益。自21世紀(jì)之后，中國(guó)的玉米種植面積就一直呈上升趨勢(shì)，溫室效應(yīng)的出現(xiàn)、連茬種植、秸稈還田措施的推行、玉米密植技術(shù)的推廣，大大增加了玉米螟等病蟲(chóng)害發(fā)生的可能性[2]。目前，防治玉米螟的主要方法是化學(xué)防治，但易產(chǎn)生抗藥性，用藥量逐年上升;而化學(xué)農(nóng)藥的殘留，影響產(chǎn)品品質(zhì)，尤其影響鮮食玉米的食品安全。蘇云金芽孢桿菌作為一種廣譜性強(qiáng)、殺蟲(chóng)速度快、毒力高的生防微生物，在玉米螟的生物防治中發(fā)揮著重要作用。黑龍江省自2011年起已實(shí)施玉米螟綠色防控工程，采用湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的玉米螟專(zhuān)用蘇云金桿菌可濕性粉劑和油懸浮劑，采取飛機(jī)噴霧或自走式高桿噴霧車(chē)地面噴霧大面積防治，取得了很好的防效。對(duì)玉米螟高毒力的蘇云金芽孢桿菌的分離、選育是玉米螟綠色防控效果的關(guān)鍵因子。

誘變育種技術(shù)仍然是現(xiàn)在世界各國(guó)廣泛使用的菌株選育技術(shù)，傳統(tǒng)的誘變育種方法如紫外線輻照（UV）、亞硝基胍（NTG）、Co60γ射線輻照等方法都頗有成效[3]，但UV能量較大，會(huì)殺死細(xì)胞，極易對(duì)人體造成巨大傷害;NTG有毒，有致癌的可能性;電離輻射有一定的局限性，操作要求高且有一定的危險(xiǎn)性，因此傳統(tǒng)的誘變方法對(duì)試驗(yàn)操作者的人身安全有很大的潛在危險(xiǎn)。由清華大學(xué)自主研發(fā)的新型常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)是新興的一種誘變技術(shù)，因其具有基因損傷強(qiáng)度高、突變范圍廣、處理?xiàng)l件溫和、安全無(wú)輻射、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)[4]，已廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵高產(chǎn)菌株。本研究以實(shí)驗(yàn)室篩選保存的對(duì)玉米螟有特異性、高毒力的蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株為出發(fā)菌株，通過(guò)ARTP誘變育種，篩選獲得一株遺傳性能穩(wěn)定、對(duì)玉米螟毒力得到明顯提高的突變菌株，其發(fā)酵液生物效價(jià)和殺蟲(chóng)晶體蛋白含量均有所提高，為玉米螟綠色防控工程提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株? 蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心從土壤中分離篩選。

1.1.2? 供試蟲(chóng)? 玉米螟采自黑龍江省，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲(chóng)室保種并培養(yǎng)，提供供試二齡幼蟲(chóng)。

1.1.3? 培養(yǎng)基? 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L，pH調(diào)至6.8～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基，玉米淀粉30 g/L、酵母浸粉? ?5 g/L、蛋白胨5 g/L、MgS04·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 1 g/L、花生餅粉20 g/L、魚(yú)粉10 g/L，pH調(diào)至7.5。培養(yǎng)基滅菌溫度為121 ℃，時(shí)間為30 min。

1.1.4? 試劑與儀器? 常壓室溫等離子體誘變機(jī)（無(wú)錫源清天木生物科技有限公司）;恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）;721可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）;超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2? 菌株的ARTP誘變

1.2.1? 芽孢懸浮液的制備? 將保藏于砂土管的蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌種直接轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)壯，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，挑起一環(huán)菌苔轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨液體搖瓶中（100 mL/500 mL三角瓶），220 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)至芽孢全部形成。離心收集芽孢，然后無(wú)菌水稀釋?zhuān)苽湟欢舛鹊难挎邞乙?，OD600 nm在0.3～0.5，作為誘變母液。

1.2.2? 菌株的ARTP誘變? 在超凈工作臺(tái)中用移液槍移取10 μL的誘變母液，均勻涂抹在直徑為6 mm的無(wú)菌金屬墊片上，將其置于無(wú)菌平皿內(nèi)移至提前開(kāi)機(jī)預(yù)熱20 min的ARTP誘變機(jī)中，電源功率為100 W，處理距離2 mm，工作氣流量10 slpm，以氦氣為工作氣體，以處理時(shí)間為誘變的主要操作參數(shù)，誘變時(shí)間設(shè)置為20、40、60、80、100、120 s。誘變處理完成以后取出金屬墊片放入裝有1 mL無(wú)菌水的EP管中，渦旋振蕩1 min。取經(jīng)振蕩的菌液稀釋至適當(dāng)濃度涂平板，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。經(jīng)上述條件培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)各平板上單菌落個(gè)數(shù)，取3次平均值，繪制出致死率曲線。

1.2.3? ARTP誘變致死率的計(jì)算? ARTP誘變致死率的計(jì)算參照以下公式：

致死率=（A-B）/A×100%

式中，A為誘變處理前芽孢懸液的活芽孢濃度;B為誘變處理后芽孢懸液中活芽孢濃度。

1.3? 誘變菌株的篩選

1.3.2? 搖瓶篩選? 將斜面鏡檢確定的芽孢形成率高、營(yíng)養(yǎng)體少、晶體比例高、晶體整齊的突變株接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL三角瓶每瓶裝量50 mL），30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)30 h，涂片染色后鏡檢。

1.3.3? 發(fā)酵液生物效價(jià)測(cè)定和殺蟲(chóng)晶體蛋白質(zhì)含量測(cè)定? 挑取搖瓶發(fā)酵鏡檢確定的芽孢形成率高于90%、菌體整齊、生長(zhǎng)速度快、晶體大小整齊的突變株發(fā)酵液進(jìn)行生物效價(jià)測(cè)定和殺蟲(chóng)晶體蛋白含量測(cè)定。

1.3.4? 砂土管保存? 挑取發(fā)酵液生物效價(jià)和殺蟲(chóng)晶體蛋白含量均高于出發(fā)菌株10%以上的菌株，刮下芽孢放入已滅菌并經(jīng)無(wú)菌檢查的砂土管中，用接種環(huán)打散混勻，置于干燥器中保存。

1.4? 生物活性測(cè)定和殺蟲(chóng)晶體蛋白含量測(cè)定

1.4.1? 對(duì)玉米螟生物活性測(cè)定? 生物活性測(cè)定采用混菌法，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19567.1-2004中棉鈴蟲(chóng)生物測(cè)定方法進(jìn)行[5];將發(fā)酵液稀釋至一定濃度，每樣品設(shè)3個(gè)濃度，取適量與飼料混合均勻，倒入24孔板，晾干后接玉米螟二齡幼蟲(chóng)，設(shè)空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，封嚴(yán)24孔板，于25 ℃培養(yǎng)72 h，檢查各處理死亡及存活蟲(chóng)數(shù)，并計(jì)算發(fā)酵液生物效價(jià)[6]。

1.4.2? 殺蟲(chóng)晶體蛋白含量測(cè)定? 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19567.1-2004中蘇云金桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白含量測(cè)定方法進(jìn)行[5]。

1.5? 數(shù)據(jù)處理及分析方法

生物測(cè)定數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析，計(jì)算LC50和95%置信區(qū)間[7]。

1.6? 突變株遺傳穩(wěn)定性分析

在斜面培養(yǎng)基上活化篩選得到高毒力的菌株，培養(yǎng)96 h，連續(xù)在斜面上轉(zhuǎn)接5次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，分別進(jìn)行顯微鏡檢芽孢形成率、生物活性測(cè)定、殺蟲(chóng)晶體蛋白含量測(cè)定，比較突變株毒力的穩(wěn)定性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? ARTP誘變時(shí)間的選擇

不同誘變時(shí)間下蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株芽孢懸液ARTP處理的致死率曲線如圖1所示。從圖1中看出，隨著處理時(shí)間的增加，菌體的存活率逐漸降低。40 s以后，致死率大幅度上升，這說(shuō)明蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株對(duì)ARTP較敏感，產(chǎn)生的致突變能力較大，處理60 s后致死率在90%左右，但當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到80 s時(shí)，ARTP的誘變作用較為劇烈，致死率達(dá)到95.6%。當(dāng)處理時(shí)間100 s時(shí)，致死率接近100%。綜合考慮菌株致死率、菌株的生物活性，為提高獲得生產(chǎn)能力和生存能力較強(qiáng)菌株的概率，故選定致死率到達(dá)80%～90%左右作為誘變依據(jù)[8，9]，本研究中選定ARTP處理時(shí)間為60 s，此時(shí)致死率為89.3%。

2.2? 高產(chǎn)突變株的篩選

2.2.1? 斜面初篩? 將ARTP誘變時(shí)間60 s并經(jīng)5次單菌落分離得到的749株斜面進(jìn)行涂片鏡檢，斜面鏡檢芽孢形成率高、營(yíng)養(yǎng)體少、晶體率高、晶體整齊的菌株，共得到76株優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行下一輪搖瓶發(fā)酵。5次鏡檢初篩優(yōu)勢(shì)菌株比例在10%左右，鏡檢情況如表1所示。

2.2.2? 搖瓶篩選? 將斜面鏡檢初篩得到的76株優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并設(shè)出發(fā)菌株作對(duì)照。30 h分別涂片鏡檢，得到15株發(fā)酵芽孢形成率高于95%，菌體整齊，對(duì)晶體大、形態(tài)好的突變株分別進(jìn)行生物活性測(cè)定和殺蟲(chóng)晶體蛋白含量測(cè)定，3次重復(fù)取平均值，結(jié)果如表2所示。采用生物效價(jià)和晶體蛋白雙指標(biāo)進(jìn)行高毒力突變菌株的判定，生物效價(jià)和晶體蛋白含量均高于出發(fā)菌株20%的菌株有7株，分別是NBIC-380-401、NBIC-380-402、NBIC-380-406、NBIC-380-407、NBIC-380-410、NBIC-380-411、NBIC-380-415。

2.3? 高毒力突變株的搖瓶復(fù)篩

將搖瓶篩選得到的7株高毒力突變株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并設(shè)出發(fā)菌株作對(duì)照。30 h分別涂片顯微鏡檢，進(jìn)行生物活性和殺蟲(chóng)晶體蛋白含量測(cè)定，3次重復(fù)取平均值，結(jié)果如表3所示。綜合搖瓶發(fā)酵芽孢形成率、發(fā)酵周期、生物效價(jià)和晶體蛋白含量，NBIC-380-402、NBIC-380-407兩菌株各種指標(biāo)均優(yōu)于其他菌株，其中NBIC-380-407菌株效價(jià)較出發(fā)菌株提高25.7%，晶體蛋白含量提高18.9%，發(fā)酵性能優(yōu)良。

2.4? 突變高毒力菌株的遺傳穩(wěn)定性

為了檢測(cè)突變株的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)突變高產(chǎn)株NBIC-380-18-407在試管斜面上連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，顯微鏡檢，然后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)酵液的生物效價(jià)和殺蟲(chóng)晶體蛋白含量，結(jié)果（表4）表明，隨著傳代次數(shù)的增加，菌株的晶體形態(tài)、芽孢形成率、發(fā)酵液的殺蟲(chóng)活性及殺蟲(chóng)晶體含量等各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化，至第5次傳代后也較為穩(wěn)定。這說(shuō)明通過(guò)ARTP誘變所獲得的突變株NBIC-380-18-407具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可作為工業(yè)生產(chǎn)菌株。

3? 討論

化肥農(nóng)藥減施增效是關(guān)系到中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全的戰(zhàn)略性問(wèn)題。通過(guò)傳統(tǒng)菌種選育、誘變育種及現(xiàn)代分子技術(shù)手段，建立高效快速的高活性菌株選育方法與手段，篩選獲得高活性或高生態(tài)適應(yīng)性的菌株，創(chuàng)制安全高效的生物殺蟲(chóng)劑，有助于改變中國(guó)食品安全現(xiàn)狀，具有廣闊的發(fā)展前景，其社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益是顯而易見(jiàn)的。誘變育種是工業(yè)化生產(chǎn)中選育高活性菌株的重要有效手段。相對(duì)于其他傳統(tǒng)誘變技術(shù)，ARTP誘變育種具有操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、條件溫和、安全性高、一次操作可獲得大量的突變體等優(yōu)異性能，達(dá)到高效育種的目的。本研究利用ARTP對(duì)玉米螟高毒力菌株蘇云金芽孢桿菌NBIC-380進(jìn)行誘變，通過(guò)斜面鏡檢初篩、搖瓶三輪復(fù)篩，獲得發(fā)酵效價(jià)6 835 IU/μL晶體蛋白含量6.3 mg/mL，并且遺傳穩(wěn)定的突變菌株NBIC-380-18-407，建立了一套高效的篩選方法，為芽孢桿菌的菌種選育提供了參考方法。突變株發(fā)酵水平較初始菌株提高20%以上，提升了產(chǎn)品質(zhì)量，在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中可顯著降低生產(chǎn)成本。

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