白雪潔+于文靜+汪億晗+石磊+蘇蕊+徐銳鋒+陳大舟+楊洪梅+劉淑瑩

摘要應(yīng)用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（ICRMS）的電子捕獲解離（ECD）技術(shù)對寡糖異構(gòu)體進行識別。以麥芽七糖、甘露六糖和昆布六糖為研究對象，通過在樣品中添加過渡金屬離子（Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+和Co2+），研究不同金屬離子對寡糖碎裂的影響。加合Ba2+和Ca2+后的麥芽七糖得到了相同的碎裂離子（0，2A和2，A），Mg2+和Mn2+也具有相似的影響（0，2A、2，A和2，5A），Co2+加合的麥芽七糖也得到了3個交叉環(huán)斷裂離子（1，A、2，A和2，5A），但對于加合Na+后的麥芽七糖僅得到了一個交叉環(huán)斷裂離子（0，2A）。 研究發(fā)現(xiàn)， 六聚糖的質(zhì)譜圖的信號比相應(yīng)的麥芽七糖的信號差，應(yīng)是締合的金屬離子的數(shù)量不同導(dǎo)致的結(jié)果； 區(qū)分寡糖異構(gòu)體比較好的金屬離子為Ca2+、Co2+和Mg2+，其中Ca2+是區(qū)分寡糖異構(gòu)體的更可靠的電荷載體。

關(guān)鍵詞傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜； 電子捕獲解離； 金屬離子； 寡糖異構(gòu)體

1引 言

寡糖是生物體內(nèi)重要的信息物質(zhì)，糖在多種生物過程中起著重要的作用，如抗凝活性、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抑制致病微生物、抗氧化、抗炎活性等[1～3]。糖蛋白的糖鏈部分能調(diào)節(jié)多種基本功能，例如蛋白質(zhì)的折疊、運輸、定位和細胞轉(zhuǎn)化、分化與反分化等[]，但生物來源的糖蛋白樣品往往非常微量，分離純化的難度大，加上糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和技術(shù)手段的局限性，對糖鏈結(jié)構(gòu)的分析遠滯后于對其功能的研究，嚴重制約了糖鏈結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究。傳統(tǒng)的寡糖的分析方法包括核磁共振（NMR）、氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）和單糖的組成分析的結(jié)合[5，6]，但NMR靈敏度低，對樣品純度要求高，目前在天然樣品的分析中無法得到廣泛應(yīng)用。質(zhì)譜技術(shù)，特別是基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）和電噴霧離子化（ESI）質(zhì)譜的發(fā)展，憑借其靈敏、快速、準確、可分析復(fù)雜混合物和利用串聯(lián)質(zhì)譜可獲得豐富結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點成為目前闡述糖的結(jié)構(gòu)的重要方法[7，8]。近年來，MALDI及實時直接分析（DAR）源內(nèi)裂解的方法、離子淌度質(zhì)譜以及氨基酸輔助ESIMS/MS的方法也都被成功用于糖的異構(gòu)體的識別[9～12]，但應(yīng)用這些方法所獲得的碎裂類型相似。

電子捕獲解離（ECD）一般是通過低能量（<1 eV）的自由電子與質(zhì)子化的多電荷離子，在相互作用的過程中由于放熱而瞬間碎裂，產(chǎn)生電荷減少的自由基物質(zhì)和產(chǎn)物離子[13～16]。目前ECD與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用技術(shù)（ECDMS）已成功用于蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)糖基化的翻譯后修飾的分析[17～22]，ECD的主要特征包括優(yōu)先斷裂二硫鍵[19]和NCa鍵[20]。同傳統(tǒng)的MS2分析方法比較，ECD的這些特征可以提供補充的結(jié)構(gòu)信息。但ECD很少用于糖的結(jié)構(gòu)的分析，主要是由于糖不可以產(chǎn)生多電荷離子，第一個應(yīng)用ECD分析質(zhì)子化糖的研究主要檢測到了糖苷鍵斷裂的離子[23]。目前，關(guān)于ECD的機理尚不清楚，并且只局限于多肽的研究，一般認為是熱氫原子機理[1]。uang等[2]以纖維二糖Mg2+復(fù)合物為研究對象，提出了羥基抽提機理。 本研究通過在樣品中添加金屬離子作為電荷載體，使寡糖產(chǎn)生多電荷離子，應(yīng)用ECD傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（ICRMS）對產(chǎn)生的二價離子進行分析，獲得了獨特的用于區(qū)分寡糖異構(gòu)體的交叉環(huán)斷裂離子。對不同金屬離子進行了詳細研究，發(fā)現(xiàn)碎裂類型具有金屬離子依賴性。本研究建立了一種簡單、快速、可靠的用于識別寡糖異構(gòu)體的方法，為未知及復(fù)雜糖結(jié)構(gòu)的ECDICRMS解析提供了參考。

2實驗部分

21儀器與試劑

Apexultra 9 傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（ICRMS，德國Bruker公司），配有Nano ESI源和ECD檢測器。麥芽七糖（日本東京化成工業(yè)株式會社）； 甘露六糖和昆布六糖（Megazyme國際愛爾蘭股份有限公司），麥芽七糖、甘露六糖和昆布六糖的結(jié)構(gòu)如圖1所示。醋酸鈉、醋酸鈣、醋酸鋇、醋酸鈷、醋酸鎂和醋酸錳（北京百靈威科技有限公司）； 甲醇（色譜級，美國EDIA公司）； 實驗用水為MilliQ超純水機（美國Millipore公司）制備的超純水（182 MΩ cm）。

22ECDICRMS條件

02 mg/mL被分析物與同體積10 mmol/L醋酸鹽混合后直接進NanoESI進行分析。

NanoESI源正離子模式采集，Nano噴針流速30 mL/h，毛細管電壓18 kV，干燥氣溫度150℃，干燥氣流量3 L/min，ECD脈沖持續(xù)時間01 s，ECD偏壓05 V，ECD鏡頭電壓13 V，ECD加熱電流18 A。

3結(jié)果與討論

本研究使用Domon和Costello命名法[25]定義寡糖的碎片離子，電荷保留在非還原端的離子定義為k，lAi（交叉環(huán)斷裂）、Bi和Ci（糖苷鍵斷裂），下標i代表從非還原端開始的糖苷鍵斷裂的編號； 電荷保留在還原端的離子定義為k，lXj（交叉環(huán)斷裂）、Yj和j（糖苷鍵斷裂），下標j代表從還原端開始的糖苷鍵斷裂的編號。無特殊指出時，所有寡糖在正離子模式下主要產(chǎn)生金屬離子加合峰。為了更加清晰明了，不同的碎片離子名稱用不同的顏色標出，綠色： Y離子； 紅色：B離子； 藍色： 0，2A離子； 紫色： 2，A離子； 粉色：2，5A離子； 棕色： 1，A離子。

31Ca2+作為電荷載體

以麥芽七糖、甘露六糖和昆布六糖為研究對象，Ca2+作為電荷載體獲得的結(jié)果如圖2所示。圖2A中除主要獲得了B和Y離子，還檢測到了大量交叉環(huán)斷裂的0，2A和2，A離子。為了研究以Ca2+作為電荷載體能否區(qū)分糖的異構(gòu)體，對甘露六糖和昆布六糖進行了分析。對比圖2B和圖2C可見，圖2B中的交叉環(huán)斷裂離子主要為2，A離子，而在圖2C中還檢測到2，5A和1，A離子，2，5A碎裂離子在ESI及MALDI串聯(lián)質(zhì)譜中無法檢測到[9，26]?？梢娨訡a2+作為電荷載體，可以很容易地識別糖的異構(gòu)體。另外，通過比較圖2中的A、B和C發(fā)現(xiàn)， 六聚糖的質(zhì)譜圖的信號比相應(yīng)的麥芽七糖的信號差，應(yīng)該是由于締合的金屬離子的數(shù)量不同導(dǎo)致的結(jié)果[27]，糖鏈越長，締合金屬離子的能力越強，因此信號越好。endprint

32不同金屬離子的比較

不同金屬離子獲得的結(jié)果列于表1。麥芽七糖的ECDICR 質(zhì)譜圖的信噪比較高，因此以麥芽七糖為例分析金屬離子的影響。加合Ba2+和Ca2+后的麥芽七糖得到了相同的碎裂離子類型（0，2A和2，A），Mg2+和Mn2+的影響是相似的（0，2A、2，A和2，5A），Co2+加合的麥芽七糖也得到了3種交叉環(huán)斷裂離子（1，A、2，A和2，5A），但對于加合Na+后的麥芽七糖僅得到了一個交叉環(huán)斷裂離子（0，2A）。Seipert等[28]研究了影響糖肽ECD碎裂的因素，發(fā)現(xiàn)電荷狀態(tài)、電荷載體和氨基酸組成都會影響碎裂。同時，金屬離子的大小對寡糖MALDI碎裂有不同程度的影響[27]，推測是由于金屬離子的大小及電荷狀態(tài)的不同導(dǎo)致的。

從表1獲得的甘露六糖和昆布六糖的ECDMS結(jié)果可見，Ca2+、Co2+和Mg2+都可作為區(qū)分寡糖異構(gòu)體的金屬離子，但使用Ca2+作為電荷載體時能獲得更豐富的交叉環(huán)斷裂離子，因此Ca2+作為識別寡糖異構(gòu)體的電荷載體更可靠。

結(jié) 論

本研究應(yīng)用ICRMS的ECD技術(shù)研究了不同金屬離子對寡糖碎裂的影響，對寡糖異構(gòu)體進行了識別。通過分析比較，麥芽七糖的ECD ICRMS中觀察到了較多的交叉環(huán)斷裂離子，不同連接、不同構(gòu)型的甘露六糖和昆布六糖的ECD質(zhì)譜圖中觀察到的碎片離子也有所不同，細微差別主要由金屬離子的大小及電荷狀態(tài)的不同導(dǎo)致的。區(qū)分寡糖異構(gòu)體比較好的金屬離子為Ca2+、Co2+和Mg2+，其中Ca2+是區(qū)分寡糖異構(gòu)體的更可靠的電荷載體。同傳統(tǒng)的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)相比，ECD的碎裂效率比較低，因此選擇能最大化前體離子信號的金屬離子是一個需要考慮的重要因素。 本研究證實了ECD技術(shù)結(jié)合添加的金屬離子可以獲得常規(guī)串聯(lián)方法無法檢測到的獨特的交叉環(huán)斷裂離子，是寡糖結(jié)構(gòu)鑒定的強有力的工具，為使用ECDMS分析寡糖結(jié)構(gòu)提供了理論參考。

References

1akomori S Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99（1）： 225-232

2hang X Curr Med Chem， 2006， 13（10）： 111-117

3Dwek R A Chem Rev， 1996， 96（2）： 683-720

Yin ， Du Y， hang Curr op Med Chem， 2009， 9（16）： 156-1559

5Bock K， SchusterKolbe ， Altman E， Allmaier G， Stahl B， Christian R， Sleytr U B， Messner P Biol Chem， 199， 269（10）： 7137-71

6ahringer U， Wagner ， Rietschel E ， BenMenachem G， Deutsch ， Rottem S Biol Chem， 1997， 272（2）： 26262-26270

7arvey D Mass Spectrom Rev， 2011， 30（1）： 1-100

8Dell A， Morris R Science， 2001， 291（5512）： 2351-2356

9Yang ， Yu Y， Song ， Liu S Am Soc Mass Spectrom， 2011， 22（5）： 85-855

10Yang ，Shi L， Yao W， uang L， Wang Y， Wan D， Liu S Am Soc Mass Spectrom， 2015， 26（9）： 1599-1605

11Yang ， Shi L， Yao W， huang X， Wan D， Song ， Li ， Liu S Sci Rep， 2016， 6： 28079

12Yuan ， Ying ， Deng P， Chen P， Shi ， Liu Y， Gao X， hao Y Analyst， 2015， 10（23）： 7965-7973

13ubarev R A， Kelleher N L， Mclafferty W Am Chem Soc， 1998， 120（13）： 3265-3266

1ubarev R A， Kruger N A， ridriksson E K， Lewis M A， orn D M， Carpenter B K， Mclafferty W Am Chem Soc， 1999， 121（12）： 2857-2862

15ubarev R A， aselmann K ， Budnik B， Kjeldsen ， ensen Eur Mass Spectrom， 2002， 8（5）： 337-39

16Syrstad E A， Stephens D D， urecek Phys Chem A， 2003， 107（1）： 115-126

17YU ing， LI XiaoMin， LI ongMei， ANG Qinge， LI XiuQin， SAO ShuLi Chinese Anal Chem， 2015， 3（）： 56-569

于 晶， 李曉敏， 李紅梅， 張慶和，李秀琴，邵淑麗 分析化學， 2015， 3（）： 56-569

18Yan Y， Kusalik A ， Wu X IEEEACM rans Comput Biol Bioinform， 2017， 1（2）： 337-3

19ubarev R A， Kruger N A， ridriksson E K， Lewis M A， orn D M， Carpenter B K， McLafferty W Am Chem Soc， 1999， 121（12）： 2857-2862endprint

20Chen X， Chan W Y， Wong P S， Yeung S， Chan W Am Soc Mass Spectrom， 2011， 22（2）： 233-2

21hang Y， Cui W， Wecksler A ， hang ， Molina P， Deperalta G， Gross M L Am Soc Mass Spectrom， 2016， 27（7）： 1139-112

22Adamson ， akansson K Proteome Res， 2006， 5（3）： 93-501

23Budnik B A， aselmann K ， Elkin Y N， Gorbach V I， ubarev R A Anal Chem 2003， 75（21）： 599-6001

2uang Y， Pu Y， Yu X， Costello C E， Cheng L Am Soc Mass Spectrom， 201， 25（8）： 151-160

25Domon B， Costello C E Glycoconj ， 1988， 5（）： 397-09

26Wan D， iao L， Yang ， Liu SPlanta， 2012， 235（6）： 1289-1297

27Cancilla M ， Penn S G， Carroll A， Lebrilla C B Am Chem Soc， 1996， 118（28）： 6736-675

28Seipert R R， Dodds E D， Clowers B ， Beecroft S M， German B， Lebrilla C B Anal Chem， 2008， 80（10）： 368-3692

AbstractOligosaccharide isomers were distinguished by electron capture dissociation ourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry （ECDICRMS） in combination with utilizing alkali， alkaline earth， and transition metals （Na+， Ca2+， Ba2+，Mg2+， Mn2+ and Co2+） as charge carriers in electrospray Maltoheptaose， mannohexaose and laminarihexaose were taken as examples to investigate influence of metal ions on the extent of oligosaccharide fragmentation he same types of fragmentation ions （0，2A and 2，A） were obtained for barium and calciumadducted maltoheptaose Mg2+ and Mn2+ had the similar influence （0，2A， 2，A and 2，5A） hree crossring cleavage ions （1，A， 2，A and 2，5A） were generated in the spectrum of cobaltassociated maltoheptaose But in the case of doping Na+ into maltoheptaose， only 0，2A ion was detected It was found that the signals in the spectra of mannohexaose and laminarihexaose were worse than that in the spectrum of maltoheptaose， probably resulting from different numbers of adducted metal ions he isomers， mannohexaose and laminarihexaose could be distinguished by ECDMS in conjunction with the addition of Ca2+， Mg2+ or Co2+ he addition of Ca2+ was the best choice for analysis of oligosaccharides

Keywordsourier transformion cyclotron resonancemass spectrometry； Electron capture dissociation； Metal ion； Oligosaccharide isomerendprint