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        慢性低O2高CO2對小鼠海馬細(xì)胞凋亡、caspase-3和p38 MAPK活性的影響

        2018-01-18 09:42:56任惠明王小同袁海康翰林
        關(guān)鍵詞:磷酸化海馬小鼠

        任惠明,王小同,袁海,康翰林

        (1.寧波市第二醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科,浙江 寧波 315010;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腦科康復(fù)中心,浙江 溫州 325027;3.合肥市第二人民醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科,安徽 合肥 230011;4.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,江西 贛州 341000)

        慢性低O2高CO2普遍存在于慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD)和阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)等呼吸系統(tǒng)疾病患者中。COPD患者可伴有明顯認(rèn)知功能障礙,增加COPD患者急性加重的風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致日常活動受限,增加住院率和病死率[1]。OSAS患者也存在認(rèn)知功能損害,尤以記憶功能減退為突出表現(xiàn)[2]。慢性低O2高CO2模型可以模擬這類疾病的病理生理過程,進(jìn)一步研究該類疾病引起的認(rèn)知功能障礙[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)海馬細(xì)胞凋亡可能是慢性低O2高CO2導(dǎo)致腦功能損害的重要機(jī)制之一[5],但具體機(jī)制尚未明確。p38 MAPK屬于應(yīng)激激活的蛋白激酶,參與了多種因素所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,是近些年研究的熱點(diǎn)[6],caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶之一。本研究通過建立慢性低O2高CO2小鼠模型,觀察海馬細(xì)胞凋亡以及p38 MAPK、caspase-3活性情況,初步探討慢性低O2高CO2模型小鼠海馬細(xì)胞的凋亡機(jī)制。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:雄性C57BL/6小鼠24只,9~10月齡,體質(zhì)量26~28 g,溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF條件下繁殖,動物使用許可證號:wydy 2012-0079。

        1.1.2 儀器和試劑:常壓低O2高CO2艙(溫州醫(yī)科大學(xué)肺心病研究室制),CYESIl型O2、CO2氣體測定儀(上海市嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠),熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司),酶標(biāo)儀(美國ABI公司)。兔抗鼠磷酸化p38 MAPK、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗、β-tublin抗體均購自美國Cell Signal Technology公司,caspase-3活性測定試盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

        1.2 方法

        1.2.1 模型建立:雄性C57BL/6小鼠24只隨機(jī)分為2組,分別為正常對照組(NC組)、低O2高CO24周組(4HH),每組12只。參照文獻(xiàn)方法[7],將4HH組小鼠置于常壓低O2高CO2艙內(nèi),通過N2調(diào)節(jié)艙內(nèi)O2濃度維持在9%~11%,CO2濃度為5.5%~6.5%,每天8 h,每周6 d。其余時(shí)間與NC組在同一室內(nèi)(室溫15~20 ℃,相對濕度50%~70%),持續(xù)4周。

        1.2.2 取材:造模結(jié)束后腹腔注射戊巴比妥鈉行全身麻醉,仰臥固定,0.9%氯化鈉溶液心臟灌注,斷頭,剝離顱骨,快速分離海馬,取左半放入液氮保存,右半放入4%多聚甲醛中固定,分別用于p38 MAPK、caspase-3活性測定和凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)測定。

        1.2.3 海馬CA1區(qū)細(xì)胞AI檢測(原位缺口末端標(biāo)記TUNEL法):石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,按照試劑盒說明書操作,熒光顯微鏡觀察,有熒光顯示者為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野,記錄凋亡細(xì)胞數(shù),AI用凋亡細(xì)胞數(shù)/100表示,同一張切片由3名不同實(shí)驗(yàn)人員讀數(shù),并取平均值。

        1.2.4 caspase-3活性檢測:按照caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作,取海馬組織稱重,每10 mg組織加入100 μL裂解液,冰浴勻漿。勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,冰浴裂解5 min,4 ℃ 20 000轉(zhuǎn)離心15 min。將上清、反應(yīng)緩沖液、底物(AC-DEVD-ρNA)加至酶標(biāo)板37 ℃孵育1 h,酶標(biāo)儀405 nm波長測定吸光度(A)值,重復(fù)測量3次取平均值。

        1.2.5 Western blot檢測海馬p-p38 MAPK蛋白含量:蛋白裂解液提取蛋白,BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Pierce公司)測定蛋白濃度,依次進(jìn)行SDSPAGE電泳(10%分離膠、4%濃縮膠)、轉(zhuǎn)膜、封閉,孵育盒中注入5% BSA稀釋的兔抗鼠磷酸化p38 MAPK單克隆抗體(1∶500)及內(nèi)參β-actin(1∶2 000),4 ℃孵育過夜之后注入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h后化學(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)5 min,接著在暗室中用X膠片感光,然后顯影90 s,最后定影3 min。Quantity One凝膠軟件系統(tǒng)分析磷酸化p-p38 MAPK和內(nèi)參β-actin光密度值,蛋白磷酸化p38 MAPK條帶光密度和內(nèi)參β-actin光密度比值代表p-p38 MAPK的光密度值,重復(fù)3次獨(dú)立試驗(yàn)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),正態(tài)性計(jì)量資料以 ±s表示;多組間比較采用單因素方差分析;組間兩兩比較用Levene進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 海馬細(xì)胞AI NC組偶見細(xì)胞凋亡,AI為1.23±0.32,4HH組細(xì)胞凋亡較NC組明顯增加,AI為7.38±1.29,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1。2.2 海馬caspase-3活性 NC組caspase-3活性偏低,為0.0205±0.0035,4HH組caspase-3活性較NC組明顯增加,為0.0718±0.0085,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

        2.3 海馬p-p38 MAPK蛋白含量 NC組p-p38 MAPK相對蛋白含量較低,為0.25±0.022,4HH組p-p38 MAPK相對蛋白含量為0.46±0.052,較NC組明顯增加,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。

        圖1 2組小鼠海馬凋亡細(xì)胞(TUNEL,×400)

        圖2 2組小鼠海馬p-p38 MAPK的表達(dá)量

        3 討論

        MAPK是哺乳動物體內(nèi)重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),一般位于胞漿,受刺激后磷酸化而活化,然后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),通過激活靶基因而參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化以及凋亡等病理生理過程,MAPK家族成員主要有Erk1/2、JNK、p38以及Erk5[8]。p38是由360個(gè)氨基酸組成的38 kD的蛋白,可被多種應(yīng)激反應(yīng)激活,因此與JNK一起被稱為應(yīng)激激活的蛋白激酶,可通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。在腦缺血缺氧模型中p38及JNK通路均被激活[9-10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)JNK表達(dá)較正常對照組明顯增加,本研究發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2模型小鼠海馬磷酸化p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯升高,因此慢性低O2高CO2模型動物海馬中JNK、p38通路均被激活。

        caspase-3被稱為細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者,是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路,是多種凋亡途徑的共同下游部分[12]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2模型小鼠海馬AI較對照組明顯增高,與之前研究結(jié)果[5,13]相一致,而且慢性低O2高CO2模型小鼠海馬caspase-3活性也較對照組明顯升高,因此本研究進(jìn)一步在分子水平證明慢性低O2高CO2模型小鼠海馬存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

        p-p38 MAPK可以通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡,其中包括激活caspase家族成員[14],慢性低O2高CO2可引起小鼠海馬細(xì)胞凋亡增加,caspase-3活性升高,p-p38 MAPK蛋白表達(dá)增強(qiáng)。因此促進(jìn)p-p38 MAPK蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)caspase-3活化可能是慢性低O2高CO2模型小鼠海馬細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

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