任惠明，王小同，袁海，康翰林

（1.寧波市第二醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，浙江 寧波 315010；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腦科康復(fù)中心，浙江 溫州 325027；3.合肥市第二人民醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230011；4.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江西 贛州 341000）

慢性低O2高CO2普遍存在于慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）和阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）等呼吸系統(tǒng)疾病患者中。COPD患者可伴有明顯認(rèn)知功能障礙，增加COPD患者急性加重的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致日常活動受限，增加住院率和病死率[1]。OSAS患者也存在認(rèn)知功能損害，尤以記憶功能減退為突出表現(xiàn)[2]。慢性低O2高CO2模型可以模擬這類疾病的病理生理過程，進(jìn)一步研究該類疾病引起的認(rèn)知功能障礙[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)海馬細(xì)胞凋亡可能是慢性低O2高CO2導(dǎo)致腦功能損害的重要機(jī)制之一[5]，但具體機(jī)制尚未明確。p38 MAPK屬于應(yīng)激激活的蛋白激酶，參與了多種因素所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是近些年研究的熱點(diǎn)[6]，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶之一。本研究通過建立慢性低O2高CO2小鼠模型，觀察海馬細(xì)胞凋亡以及p38 MAPK、caspase-3活性情況，初步探討慢性低O2高CO2模型小鼠海馬細(xì)胞的凋亡機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：雄性C57BL/6小鼠24只，9～10月齡，體質(zhì)量26～28 g，溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF條件下繁殖，動物使用許可證號：wydy 2012-0079。

1.1.2 儀器和試劑：常壓低O2高CO2艙（溫州醫(yī)科大學(xué)肺心病研究室制），CYESIl型O2、CO2氣體測定儀（上海市嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠），熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），酶標(biāo)儀（美國ABI公司）。兔抗鼠磷酸化p38 MAPK、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗、β-tublin抗體均購自美國Cell Signal Technology公司，caspase-3活性測定試盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：雄性C57BL/6小鼠24只隨機(jī)分為2組，分別為正常對照組（NC組）、低O2高CO24周組（4HH），每組12只。參照文獻(xiàn)方法[7]，將4HH組小鼠置于常壓低O2高CO2艙內(nèi)，通過N2調(diào)節(jié)艙內(nèi)O2濃度維持在9%～11%，CO2濃度為5.5%～6.5%，每天8 h，每周6 d。其余時(shí)間與NC組在同一室內(nèi)（室溫15～20 ℃，相對濕度50%～70%），持續(xù)4周。

1.2.2 取材：造模結(jié)束后腹腔注射戊巴比妥鈉行全身麻醉，仰臥固定，0.9%氯化鈉溶液心臟灌注，斷頭，剝離顱骨，快速分離海馬，取左半放入液氮保存，右半放入4%多聚甲醛中固定，分別用于p38 MAPK、caspase-3活性測定和凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）測定。

1.2.3 海馬CA1區(qū)細(xì)胞AI檢測（原位缺口末端標(biāo)記TUNEL法）：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，按照試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡觀察，有熒光顯示者為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，記錄凋亡細(xì)胞數(shù)，AI用凋亡細(xì)胞數(shù)/100表示，同一張切片由3名不同實(shí)驗(yàn)人員讀數(shù)，并取平均值。

1.2.4 caspase-3活性檢測：按照caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作，取海馬組織稱重，每10 mg組織加入100 μL裂解液，冰浴勻漿。勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，冰浴裂解5 min，4 ℃ 20 000轉(zhuǎn)離心15 min。將上清、反應(yīng)緩沖液、底物（AC-DEVD-ρNA）加至酶標(biāo)板37 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀405 nm波長測定吸光度（A）值，重復(fù)測量3次取平均值。

1.2.5 Western blot檢測海馬p-p38 MAPK蛋白含量：蛋白裂解液提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Pierce公司）測定蛋白濃度，依次進(jìn)行SDSPAGE電泳（10%分離膠、4%濃縮膠）、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育盒中注入5% BSA稀釋的兔抗鼠磷酸化p38 MAPK單克隆抗體（1∶500）及內(nèi)參β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育過夜之后注入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h后化學(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)5 min，接著在暗室中用X膠片感光，然后顯影90 s，最后定影3 min。Quantity One凝膠軟件系統(tǒng)分析磷酸化p-p38 MAPK和內(nèi)參β-actin光密度值，蛋白磷酸化p38 MAPK條帶光密度和內(nèi)參β-actin光密度比值代表p-p38 MAPK的光密度值，重復(fù)3次獨(dú)立試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)性計(jì)量資料以 ±s表示；多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較用Levene進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬細(xì)胞AI NC組偶見細(xì)胞凋亡，AI為1.23±0.32，4HH組細(xì)胞凋亡較NC組明顯增加，AI為7.38±1.29，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。2.2 海馬caspase-3活性 NC組caspase-3活性偏低，為0.0205±0.0035，4HH組caspase-3活性較NC組明顯增加，為0.0718±0.0085，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 海馬p-p38 MAPK蛋白含量 NC組p-p38 MAPK相對蛋白含量較低，為0.25±0.022，4HH組p-p38 MAPK相對蛋白含量為0.46±0.052，較NC組明顯增加，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖1 2組小鼠海馬凋亡細(xì)胞（TUNEL，×400）

圖2 2組小鼠海馬p-p38 MAPK的表達(dá)量

3 討論

MAPK是哺乳動物體內(nèi)重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，一般位于胞漿，受刺激后磷酸化而活化，然后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過激活靶基因而參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化以及凋亡等病理生理過程，MAPK家族成員主要有Erk1/2、JNK、p38以及Erk5[8]。p38是由360個(gè)氨基酸組成的38 kD的蛋白，可被多種應(yīng)激反應(yīng)激活，因此與JNK一起被稱為應(yīng)激激活的蛋白激酶，可通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。在腦缺血缺氧模型中p38及JNK通路均被激活[9-10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)JNK表達(dá)較正常對照組明顯增加，本研究發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2模型小鼠海馬磷酸化p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯升高，因此慢性低O2高CO2模型動物海馬中JNK、p38通路均被激活。

caspase-3被稱為細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，是多種凋亡途徑的共同下游部分[12]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2模型小鼠海馬AI較對照組明顯增高，與之前研究結(jié)果[5，13]相一致，而且慢性低O2高CO2模型小鼠海馬caspase-3活性也較對照組明顯升高，因此本研究進(jìn)一步在分子水平證明慢性低O2高CO2模型小鼠海馬存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

p-p38 MAPK可以通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中包括激活caspase家族成員[14]，慢性低O2高CO2可引起小鼠海馬細(xì)胞凋亡增加，caspase-3活性升高，p-p38 MAPK蛋白表達(dá)增強(qiáng)。因此促進(jìn)p-p38 MAPK蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)caspase-3活化可能是慢性低O2高CO2模型小鼠海馬細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

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