周文媛，任軍，紀元，陳曉明

（溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035）

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥。綜合乳腺癌診斷和治療的現(xiàn)狀，乳腺癌早期診斷標志物以及藥物靶點的發(fā)現(xiàn)意義重大[1-2]。GALNT6是N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（N-acetyl galactosyltransferase，GALNT）家族的重要成員[3]，有報道稱它與乳腺癌、胃癌等的發(fā)生發(fā)展存在一定的相關(guān)性[4-6]。它在乳腺癌中呈高表達狀態(tài)，但其作用機制有待進一步探討。本研究通過構(gòu)建GALNT6低表達的MCF-7細胞株，檢測GALNT6對乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移等生物學功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與載體：乳腺癌細胞MCF-7購自上海中國科學院細胞庫。GALNT6的RNA干擾載體pGPU6/GFP/Neo-GALNT6和對照載體pGPU6/GFP/Neo-shNC均由上海吉瑪技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

1.1.2 試劑：胎牛血清FBS為美國Hyclone公司產(chǎn)品，RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，胰酶細胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液（100×）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG和β-Actin小鼠單克隆抗體均購于上海碧云天生物技術(shù)研究所，CCK8試劑購于日本同仁株式會社，細胞周期檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，GALNT6兔多克隆抗體購于美國Abcam公司，PCNA兔單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，Prime Script RT Reagent Kit購于大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將細胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，用25 mL透氣細胞培養(yǎng)瓶放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃、5% CO2、95%濕度）。實驗共分3組：Mock組：未轉(zhuǎn)染組，NC組：空載體對照組，sh-GALNT6組：GALNT6低表達組。

1.2.2 Real-time PCR：采用Trizol法提取細胞總RNA，ND2000測定RNA濃度，同時觀察樣品OD260/OD280比值，比值在2.0左右時表示所提取的RNA純度較高，可用于下一步實驗。反轉(zhuǎn)錄過程根據(jù)試劑盒說明配制反應(yīng)體系（20 μL）：4 μL 5×Prime Script Buffer、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I、1 μL Oligo dTPrime、1 μL Random 6 mers（100 μL）、0.5 μL樣品RNA、 （12.5）μL RNase free H2O，將配制好的體系放入PCR儀上50 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85 ℃ 5 s終止反應(yīng)。再按照反轉(zhuǎn)錄過程根據(jù)試劑盒說明配制反應(yīng)體系（20 μL），GALNT6、GAPDH熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。用2-△△Ct法計算GALNT6的cDNA水平，并以GAPDH為內(nèi)參基因，得出目的基因的表達情況。

1.2.3 Western blot：根據(jù)BCA試劑盒說明測定提取的細胞總蛋白濃度，用5×loading Buffer調(diào)整蛋白濃度，放置加熱器內(nèi)95 ℃加熱變性10 min。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠和濃縮膠，上樣后進行SDS-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、孵育一抗（4 ℃搖床過夜）、TBST清洗、孵育二抗、TBST清洗、ECL化學發(fā)光檢測，最后利用Image Lab圖像分析軟件測定各樣本灰度值，利用灰度值進行蛋白表達強度的比較。

1.2.4 CCK8實驗：將對數(shù)期生長的細胞調(diào)整細胞濃度為8×105個/mL，接種于96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；于生長24 h、48 h、72 h、96 h后各孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)1～3 h后，在酶標儀上于450 nm處測定各孔吸光度。細胞的生長抑制率計算方法：抑制率%=（ODo-ODs）/ODo×100%（ODo：未轉(zhuǎn)染組吸光度均值；ODs：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組吸光度均值）。

1.2.5 平板克隆實驗：使用6孔板接種細胞，每孔鋪300個細胞，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到孔中出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆團（約2周）。900 μL 4%多聚甲醛固定細胞30 min，結(jié)晶紫染料染色20 min，洗去染色液，拍照記錄實驗結(jié)果。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞周期實驗：取對數(shù)生長期的各組細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為1×106/mL，取1 mL細胞懸液于1.5 mL EP管中，用70%的冷乙醇固定（2 h至過夜），染色前用PBS洗去固定液，加100 μL RNaseA水浴30 min，加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min，上機檢測。

1.2.7 劃痕愈合實驗：取對數(shù)生長期的各組細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，接種于6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，待細胞生長融合約90%時，使細胞同步后，PBS洗滌細胞，用10 μL槍頭沿直尺做劃痕標記，PBS將劃下來的細胞洗去，加入2%血清的細胞培養(yǎng)液，在顯微鏡下拍照，記為0 h。繼續(xù)將細胞放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后拍照；利用電子ruler測量細胞間距后，計算各組各時段的閉合率（%）=（Do-Ds）/Do×100%（Do：0 h細胞間距；Ds：其他時間段細胞間距）。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以 ±s表示，2組比較方差齊性，采用t檢驗，若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗；多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GALNT6的表達 Real-time PCR結(jié)果顯示，Mock組與NC組比，GALNT6 mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而sh-GALNT6組與NC組比，GALNT6 mRNA的表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，Mock組與NC組相比，GALNT6蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而sh-GALNT6組與NC組相比，GALNT6蛋白的表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-GALNT6 MCF-7細胞模型的鑒定

2.2 沉默GALNT6抑制MCF-7細胞增殖 NC組細胞24 h、48 h、72 h的平均抑制率分別是0.72%、3.40%、1.48%，sh-GALNT6組細胞24 h、48 h、72 h的平均抑制率分別是8.40%、20.99%、17.79%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Mock組、NC組、sh-GALNT6組克隆團形成數(shù)分別為：97.00±8.89、94.33±2.96、29.33±4.81，與NC組相比，sh-GALNT6組細胞的體外增殖明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。采用流式細胞儀對細胞的周期分布進行檢測。以S期和G2期細胞所占比例作為衡量細胞周期分布差異的指標，Mock組與NC組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而sh-GALNT6組（0.724±0.007）與NC組（1.021±0.038）比，S期和G2期細胞所占比例降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

2.3 沉默GALNT6對MCF-7細胞體外遷移的影響Mock組在24 h、48 h、72 h和96 h的閉合率分別是27%±3%、41%±2%、50%±3%、63%±3%；NC組在24 h、48 h、72 h 和96 h的閉合率分別是29%±4%、41%±3%、60%±4%、60%±3%；sh-GALNT6組在24 h、48 h、72 h和96 h的閉合率分別是9%±3%、14%±3%、28%±3%、30%±3%。Mock組與NC組細胞的遷移能力隨著時間的推移而增加，在72 h達到最大值，2組細胞各時間段遷移情況比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；sh-GALNT6組細胞的遷移能力也隨著時間的推移而增加，但與NC組相比，遷移能力明顯降低（P＜0.05），見圖4。

2.4 GALNT6對細胞增殖和遷移相關(guān)因子的影響Mock組與NC組相比，PCNA蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而sh-GALNT6組與NC組比，PCNA蛋白的表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5A。Mock組與NC組比，cyclinD1蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而sh-GALNT6組與NC組比，cyclinD1蛋白的表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5B。Mock組與NC組比，MUC1蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而sh-GALNT6組與NC組比，MUC1蛋白的表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5C。

圖2 平板克隆實驗檢測各組細胞的增殖能力

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞周期的分布

圖4 劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力

3 討論

糖基化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，腫瘤細胞蛋白質(zhì)糖基化的改變直接影響著腫瘤的生長、黏附、遷移和免疫監(jiān)視，而異常糖基化的糖蛋白在腫瘤的惡化侵襲及遷移中起著重要作用[6]。GALNT是一類研究較多的催化蛋白質(zhì)O-糖基化修飾的起始糖基轉(zhuǎn)移酶，將N-乙酰氨基半乳糖結(jié)合到蛋白質(zhì)肽鏈的Ser或Thr上，由于糖蛋白表面糖鏈的異常變化可以影響改變細胞的正常生物特性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]，有研究[3]表明GALNT在乳腺癌中異常表達。GALNT6是GALNT家族的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)，GALNT6在乳腺癌中處于高表達狀態(tài)[4-5]，但是其對乳腺癌細胞增殖和遷移的研究較少。

細胞增殖在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，腫瘤細胞增殖速度快，侵襲鄰近組織并發(fā)生遷移，是腫瘤遷移過程中至關(guān)重要的一步[8-9]。本研究利用低表達GALNT6的乳腺癌細胞模型研究GALNT6與乳腺癌細胞增殖和遷移的關(guān)系，進一步了解GALNT6在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，結(jié)果表明GALNT6低表達抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖和遷移。PCNA是增殖細胞核抗原因子，參與調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制，使DNA復(fù)制與細胞功能相協(xié)調(diào)，與細胞的增殖密切相關(guān)，是反映腫瘤細胞增殖狀態(tài)的良好指標[10]。有研究表明，它在細胞周期的G1期晚期和S期表達量達到峰值，不僅在DNA的合成中起直接作用，在DNA損傷修復(fù)、細胞周期控制、基因轉(zhuǎn)錄等方面也起著協(xié)調(diào)作用。本研究結(jié)果顯示GALNT6低表達抑制PCNA的蛋白水平。細胞周期素在調(diào)節(jié)細胞周期的過程中起著關(guān)鍵作用，主要有cyclinA、cyclinB、cyclinD1及cyclinE 4種，其中cyclinD1在G1期向S期的發(fā)展過程中起調(diào)節(jié)作用，是細胞周期的啟動子，它促進細胞從靜止期進入細胞分裂周期，從而使腫瘤細胞增殖加快，有研究表示乳腺癌組織中cyclinD1表達增加是預(yù)后差的一種標志[11]。本研究檢測結(jié)果顯示，cyclinD1蛋白水平的表達呈下降趨勢，表明低表達GALNT6后，細胞周期受到阻滯，并通過調(diào)節(jié)cyclinD1抑制了乳腺癌細胞的增殖。

MUC1蛋白是一種高糖基化、高分子量蛋白，又稱附膜蛋白，是跨膜分子，同時也是GALNT6糖基化底物之一，并且GALNT6可通過MUC1分子發(fā)揮對乳腺癌的影響，它在維持上皮完整性和腫瘤的發(fā)生與遷移等方面都起到重要的作用[12-13]。由于MUC1在腫瘤組織中異常表達，使其成為一種重要的腫瘤生物學標志物[14]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)GALNT6低表達會抑制MUC1的蛋白水平，表明GALNT6與乳腺癌細胞MCF-7的遷移息息相關(guān)。

綜上所述，GALNT6在乳腺癌細胞MCF-7增殖和遷移的過程中有著重要的作用，這表示GALNT6將來可能會成為治療乳腺癌的分子靶點。

圖5 Western blot檢測各組細胞目的蛋白的表達水平

[1] SMITH R A, MANASSARAM-BAPTISTE D, BROOKS D, et al. Cancer screening in the United States 2015: a review of current American cancer society guidelines and current issues in cancer screening[J]. CA Cancer J Clin , 2015,65(1): 30-54.

[2] YANG M D, CHANG W S, TSAI C W, et al. Inhibitory effects of AVEMAR on proliferation and metastasis of oral cancer cells[J].Nutr Cancer, 2016, 68(3): 473-480.

[3] PARK J H, NISHIDATE T, KIJIMA K, et al. Critical roles of mucin 1 glycosylation by transactivated polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 6 in mammary carcinogenesis[J]. Cancer Res, 2010, 70(7): 2759-2769.

[4] GAO Y, LIU Z, FENG J,et al. Expression pattern of polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase-10 in gastric carcinoma[J].Oncol Lett , 2013, 5(1): 113-116.

[5] PARK J H, NISHIDATE T, KIJIMA K, et al. Gritical roles of mucin 1 glycosylation by transactivated polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 6 in mammary carcinogenesis[J]. Cancer Res, 2010, 70(7): 2759-2769.

[6] SCHJOLDAGER K T, CLAUSEN H. Site-specific protein O-glycosylation modulates proprotein processing - deciphering specific functions of the large polypeptide GalNActransferase gene family[J].Biochim Biophys Acta, 2012,1820(12): 2079-2094.

[7] VITIAZEVA V, KATTLA J J, FLOWERS S A, et al. The O-linked glycome and blood group antigens ABO on mucintype glycoproteins in mucinous and serous epithelial ovarian tumors[J].PLoS One, 2015, 10(6): e0130197.

[8] ZHANG Q, CHEN X, ZHANG X, et al. Knockdown of TMEM14A expression by RNAi inhibits the proliferation and invasion of human ovarian cancer cells[J]. Biosci Rep,2016, 36(1):e00298.

[9] CHIU K Y, WU C C, CHIA C H, et al. Inhibition of growth,migration and invasion of human bladder cancer cells by antrocin, a sesquiterpene lactone isolated from Antrodia cinnamomea, and its molecular mechanisms[J].Cancer Lett, 2016,373(2): 174-184.

[10] KUBBEN F J, PEETERS-HAESEVOETS A, ENGELS L G,et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a new mark-

er to study human colonic cell proliferation[J].Gut,1994,35(4): 530-535.

[11] ARNOLD A, PAPANIKOLAOU A. Cyclin D1 in breast cancer pathogenesis[J].J Clin Oncol, 2015, 23(18): 4215-4224.

[12] BROCKHAUSEN I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions[J].EMBO Rep, 2006, 7(6): 599-604.

[13] REMMERS N, ANDERSON J, LINDE E, et al. Aberrant expression of mucin core proteins and o-linked glycans associated with progression of pancreatic cancer[J].Clin Cancer Res, 2013, 19(8): 1981-1993.

[14] KIM Y S, GUM J JR, BROCKHAUSEN I. Mucin glycoproteins in neoplasia[J]. Glycoconj J, 1996, 13(5): 693-707.