李富亮，劉春英，王 云，王 健，莊振娟

(安丘市人民醫(yī)院病理科，山東 安丘 262100)

完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM)和部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole，PHM)的遺傳起源、疾病進展和預后均有很大不同，CHM發(fā)生惡變的概率為15%～20%，而PHM惡變的概率僅為4%～6%[1]。水腫性流產(chǎn)胎(hydropic abortus，HA)是由于絨毛發(fā)育不良退變所形成，遺傳學表型為正常二倍體。因此，有效鑒別CHM、PHM和HA對患者的進一步治療有重要指導意義。p57作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，可以有效鑒別CHM和PHM、HA[2]。CD34是一種形成血管的再生上皮細胞的標志物，可作為水泡狀胎塊與HA和正常絨毛組織鑒別診斷的依據(jù)之一。Ki-67是一種與細胞增殖相關的核抗原，其功能與細胞有絲分裂密切相關。本研究采用免疫組織化學法檢測CHM、PHM、HA及正常胎盤組織中p57、CD34、Ki-67的表達，以期為CHM、PHM、HA的診斷與鑒別診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2003年1月至2013年12月安丘市人民醫(yī)院病理科保存的CHM組織45例、PHM組織40例、HA組織28例和正常妊娠胎盤組織22例，均經(jīng)病理學檢測確診。CHM患者的年齡為18～34(28.9±7.4)歲；PHM患者的年齡為17～36(27.5±5.6)歲；HA患者的年齡為17～35(26.9±6.8)歲；正常妊娠者的年齡為16～38(28.4±5.5)歲；CHM、PHM、HA患者及正常妊娠者的年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑RM2235切片機(德國LEICA公司)，BX51顯微鏡(日本OLYMPUS株式會社)，丹吉爾數(shù)字醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(濟南丹吉爾電子有限公司)，Costar微量加樣器(美國Costar公司)，MA200型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，DHG202型電熱干燥箱(濰坊標諾工業(yè)有限公司)，石蠟包埋機(常州郝思琳醫(yī)用儀器有限公司)。p57、CD34、Ki-67鼠抗人單克隆抗體(上海太陽生物技術有限公司)，PV-9000免疫組織化學染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3免疫組織化學法檢測CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中p57、CD34、Ki-67的表達組織標本經(jīng)40 g·L-1多聚甲醛固定過夜，制備石蠟塊，4 μm 切片，常規(guī)脫蠟至水，體積分數(shù)3%H2O2室溫孵育 5～10 min，體積分數(shù)5%～10% 正常山羊血清封閉，一抗孵育過夜(p57稀釋度1200，CD34稀釋度1500，Ki-67稀釋度1500)，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加適量辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，復染，脫水，透明，封片。

1.4結果判定及觀察(1)p57的免疫組織化學染色結果判斷參照管淑敏等[3]的方法，p57陽性表達定位于細胞核，呈棕色顆粒；顯微鏡下隨機選取4個視野，計算絨毛表面的滋養(yǎng)細胞著色，陽性細胞數(shù)大于總數(shù)的10%為陽性。滋養(yǎng)細胞不著色或散在著色，陽性細胞數(shù)小于總數(shù)的10%為陰性。(2)CD34主要表達于絨毛間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞，陽性表達為細胞質(zhì)或細胞膜可見黃色顆粒；CD34表達水平采用微血管密度(microvessel density，MVD)測定法[4]，400倍光學顯微鏡下選取5個視野，計算每個視野的MVD，取均值作為CD34陽性表達水平。(3)Ki-67陽性表達為細胞核可見棕黃色顆粒。染色強度積分：無棕黃色染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞數(shù)積分：陽性細胞數(shù)≤5% 為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。陽性細胞數(shù)積分×染色強度積分為單片染色總分，總分0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～7分為陽性(++)，≥8分為強陽性(+++)；≥2分定義為陽性。

2 結果

2.1CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中p57、CD34、Ki-67的表達結果見圖1、圖2和圖3。p57和Ki-67主要表達于滋養(yǎng)細胞、絨毛間質(zhì)細胞、蛻膜細胞的細胞核；CD34主要表達在滋養(yǎng)細胞、蛻膜細胞及絨毛及滋養(yǎng)層細胞的細胞質(zhì)和細胞膜。p57在正常妊娠組織、HA組織和PHM組織中表達較強，在CHM組織中表達較弱。CD34在正常妊娠組織和HA組織中表達較強，在PHM組織和PHM組織中表達較弱。Ki-67在CHM組織和PHM組織中表達較強，在HA組織和正常妊娠組織中表達較弱。

A：正常妊娠組織；B：CHM組織；C：PHM組織；D：HA組織。

圖1CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中p57的表達(免疫組織化學，×400)

Fig.1Expressionofp57inCHM，PHM，HAandnormalpregnancytissues(immunohistochemistry，×400)

A：正常妊娠組織；B：CHM組織；C：PHM組織；D：HA組織。

圖2CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中CD34的表達(免疫組織化學，×400)

Fig.2ExpressionofCD34inCHM，PHM，HAandnormalpregnancytissues(immunohistochemistry，×400)

A：正常妊娠組織；B：CHM組織；C：PHM組織；D：HA組織。

圖3CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中Ki-67的表達(免疫組織化學，×400)

Fig.3ExpressionofKi-67inCHM，PHM，HAandnormalpregnancytissues(immunohistochemistry，×400)

2.2CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中p57、CD34、Ki-67表達比較結果見表1。CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中p57陽性表達率分別為2.22%(3/45)、85.00%(34/40)、89.29%(25/28)、95.45%(21/22)，CHM組織中p57陽性表達率顯著低于PHM、HA及正常妊娠組織(χ2=59.908、57.055、58.238，P<0.01)，PHM、HA及正常妊娠組織中p57陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.022、0.681、0.074，P>0.05)。CD34在CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中的表達分別為10.27±3.00、11.13±2.58、35.57±2.36、35.55±2.22，CHM、PHM組織中CD34表達顯著低于HA及正常妊娠組織(t=37.89、37.86、39.79、37.40，P<0.01)，HA與正常妊娠組織中CD34表達比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.485，P>0.05)，CHM與PHM組織中CD34表達比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.404，P>0.05)。Ki-67在CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中的陽性表達率分別為64.44%(29/45)、55.00%(22/40)、14.29%(4/28)、9.09%(2/22)，CHM、PHM組織中Ki-67陽性表達率顯著高于HA及正常妊娠組織(χ2=18.21、12.61、17.53、11.56，P<0.01)，HA與正常妊娠組織中Ki-67陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.015，P>0.05)，CHM與PHM組織中Ki-67陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.787，P>0.05)。

表1CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中p57、CD34、Ki-67表達比較

Tab.1Comparisonoftheexpressionsofp57，CD34andKi-67inCHM，PHM，HAandnormalpregnancytissues

組織類型np57陰性/例(%)陽性/例(%)Ki-67陰性/例(%)陽性/例(%)CD34(MVD)正常妊娠組織221(4.55)21(95.45)20(90.91)2(9.09)35.55±2.22HA組織283(10.71)25(89.29)24(85.71)4(14.29)35.57±2.36PHM組織406(15.00)34(85.00)18(45.00)22(55.00)b11.13±2.58bCHM組織4542(97.78)3(2.22)a16(35.56)29(64.44)b10.27±3.00b

注：與PHM、HA及正常妊娠組織比較aP<0.01；與HA及正常妊娠組織比較bP<0.01。

3 討論

CHM、PHM和HA的遺傳起源、疾病進展和預后均有很大不同，有效鑒別CHM、PHM和HA對患者的進一步治療有重要意義。早期葡萄胎的圖像不容易區(qū)分，限制了早期葡萄胎的診斷。目前，葡萄胎的主要確診手段仍然是組織病理學檢查[6-8]。

大多數(shù)葡萄胎患者存在父系和母系印記基因表達紊亂，提示印記基因異常表達是葡萄胎常見的分子機制。p57作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子與抑癌因子，同時為父源性印記基因，僅在母源性等位基因表達。國外有研究顯示，p57是一項兼具靈敏性與特異性的生物學指標，有助于從遺傳基因?qū)W角度對CHM和PHM進行鑒別診斷[9]。本研究結果顯示，CHM、PHM、HA及正常妊娠組織中p57陽性表達率分別為2.22%、85.00%、89.29%、95.45%，CHM組織中p57陽性表達率顯著低于PHM、HA及正常妊娠組織，提示p57在CHM與其他胎盤絨毛水腫性病變的鑒別診斷中起重要作用。CD34是一種相對分子質(zhì)量為100 000的單鏈跨膜蛋白，由早期淋巴造血干細胞、組細胞、血管內(nèi)皮細胞、胚胎成纖維細胞和某些神經(jīng)組織細胞表達產(chǎn)生[10]，CD34是一種形成血管的再生上皮細胞的標志物，該特征可用于血管的標記。妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的典型病理表現(xiàn)之一就是絨毛間質(zhì)血管減少或消失，通過檢測CD34可以較為準確地反映妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中血管的變化。HA和正常妊娠組織絨毛間質(zhì)血管無明顯減少。因此，通過對CD34進行免疫組織化學標記血管，可以有效鑒別葡萄胎和HA。MVD可準確反映新生血管的數(shù)量。本研究結果顯示，CHM、PHM組織中CD34表達顯著低于HA及正常妊娠組織，提示CD34檢測有助于鑒別診斷葡萄胎與HA。由此說明，葡萄胎與水腫性流產(chǎn)胎的不同病理改變在于絨毛間質(zhì)血管明顯減少[11]。Ki-67是一種與細胞增殖相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，其是鑒別良惡性腫瘤、判斷腫瘤預后的一個重要輔助指標。HA屬于退行性變，滋養(yǎng)細胞增生不明顯，而葡萄胎均有不同程度的滋養(yǎng)細胞增生。本研究結果顯示，Ki-67在CHM和PHM組織中呈高表達，而在HA及正常妊娠組織中呈低表達，提示Ki-67對CHM、PHM與HA的鑒別診斷具有重要意義。

綜上所述，p57有助于鑒別CHM和其他絨毛水腫性病變，CD34和Ki-67有助于鑒別葡萄胎和HA，p57、CD34和Ki-67聯(lián)合檢測有助于CHM、PHM及HA的鑒別診斷。

[1] OTA H，ODA C，HAYASHI M，etal.Rare case of peritoneal complete hydatidiform mole[J].JObstetGynaecolRes，2014，40(4)：1154-1156.

[2] SUN S Y，MELAMED A，JOSEPH N T，etal.Clinical presentation of complete hydatidiform mole and partial hydatidiform mole at a regional trophoblastic disease center in the United States over the past 2 decades[J].IntJGynecolCancer，2016，26(2)：367-370.

[3] 管淑敏，孫麗麗，安志強，等.p57、p53、CD34蛋白在葡萄胎診斷中的應用[J].實用婦科內(nèi)分泌雜志，2016，3(2)：33-35.

[4] 何英，楊開選，王紅靜，等p57Kip2在完全性和部分性葡萄胎與流產(chǎn)伴絨毛水腫中的表達及意義[J].中華病理學雜志，2007，36(3)：197-199.

[5] 鐘萍萍，顧依群，孫云飛，等.p57、p53和Ki-67蛋白在葡萄胎診斷中的價值[J].診斷病理學雜志，2014，21(6)：391-394.

[6] 許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準[J].中國癌癥雜志，1996，6(4)：229-231.

[7] 楊紹英，劉朝榮，張志剛，等.乳腺癌新輔助化學治療前后雌激素受體、乳激素受體、Ki-67抗原和人類表皮生長因子受體-2的表達[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2017，34(2)：125-128.

[8] FOWLER D J，LINDSAY I，SECKL M J，etal.Routne pre-ecaution ultrasound diagnosis of hydatidiform mole：experience of more than 1 000 cases from a regional center[J].UltrasoundObstetGynecol，2006，27(1)：56-60.

[9] ISHIKAWA N，HARADA Y，TOKUYASU Y，etal.Re-evaluation of the histological criteria for complete hydatidiform male：comparison with the immunohistochemical diagnosis using p57 and CD34[J].BiomedRes，2009，30(3)：141-147.

[10] EL-MASRRI O，SLIM R.Familial hydatidiform mole pregnancy：the germline imprinting defect hypothesis[J].CurrTopMicrobiolImmunol，2006，301：229-241.

[11] 李昌秀，楊達榮，徐紅梅，等.p57、p53、Her-2及Ki-67在胎盤絨毛水腫性病變中的表達及其意義[J].重慶醫(yī)學，2017，46(4)：519-522.