洪娟，王冬青，殷瑞根，趙天，朱彥

（江蘇大學附屬醫(yī)院影像科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）是一種高度保守的 FAD依賴性胺氧化酶，可通過氧化去除底物甲基化的H3K4、H3K9的甲基，也可去除組蛋白以外結構上的甲基，從而影響基因表達[1－2]。諸多研究證實，LSD1過表達與多種腫瘤如乳腺癌、前列腺癌等發(fā)展、侵襲及預后不良相關[3－8]。此外，據(jù)報道，LSD1的小分子抑制劑在血液系統(tǒng)腫瘤及實體腫瘤的治療中顯示出良好的治療前景[9－10]，抑制 LSD1表達后可阻止上皮間質轉化（EMT）的進程從而延緩前列腺癌的進展[11]。本研究通過比較LSD1在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織和細胞中的表達，分析其與臨床病理特征的關系；探討外源性干擾LSD1表達后，細胞一系列生物學功能的改變及調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 收集2010年3月至2013年3月于江蘇大學附屬醫(yī)院胸外科行部分肺葉切除的52例NSCLC患者肺癌組織及癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm）。其中，男31例，女21例。年齡41～78歲，所有患者術前均未行放療、化療，所有標本均經(jīng)過病理證實。其中，鱗癌25例，腺癌27例。

1.1.2 試劑及儀器 NSCLC細胞株A549及人支氣管上皮細胞株16HBE購自中國科學院上海細胞所；RPMI 1640、DMEM、胎牛血清（美國 Gibco公司）；RNA抽提劑 Trizol、LSD1小干擾 RNA（si-LSD1）、陰性對照、轉染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；Transwell小室（美國Millipore公司）；MTT（美國Cell Signaling Technology公司）；qRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；E-鈣黏蛋白、波形蛋白及對照GAPDH抗體均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 A549肺癌細胞培養(yǎng)、分組與轉染 在37℃、相對濕度及5%CO2條件下，將A549肺癌細胞置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。同時，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)肺正常上皮16HBE細胞。取對數(shù)生長期A549肺癌細胞，并于轉染前24 h接種至6孔板（3×105個/孔），繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長融合度達70%～80%時進行轉染。轉染依照說明書，將10μL si-LSD1轉染入A549細胞中（si-LSD1組），另轉染陰性對照作為對照組，在37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)相關實驗檢測。

1.2.2 qRT-PCR檢測 LSD1和 EMT相關蛋白的mRNA表達 用Trizol提取組織和細胞總RNA，行反轉錄獲得cDNA，然后對產(chǎn)物進行擴增。GAPDH引物序列，上游：5′-GCAAATTCCATGGCACGTC-3′，下游：5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′；LSD1引物序列，上 游：5′-CAAGTGTCAATTTGTTCGGG-3′，下游：5′-TTCTTTGGGCTGAGGTACTG-3′；E-鈣黏蛋白引物序列，上游：5′-AAACCTTGCCTTCTTTGTC-3′，下游：5′-TTCCCAACTCCTCTCCTG-3′，波形蛋白引物序列，上游：5′-CGGTTCGCCAACTACAT-3′，下游：5′-AGGGC-ATCCACTTCACAG-3′。PCR反應條件：90℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以 GAPDH作為內參，采用2－ΔΔCt法計算LSD1相對表達量。

根據(jù)NSCLC組織中LSD1相對表達量的中位數(shù)，將NSCLC患者分為LSD1低表達組（≤中位數(shù)）和高表達組（＞中位數(shù)）。

1.2.3 MTT比色法實驗 取“1.2.1”轉染后細胞，接種于96孔板，每孔2×103個，每組6個復孔，獲得單細胞懸液，37℃及5%CO2飽和濕度培養(yǎng)24～96 h；每孔加入5 mg/mL MTT 20μL，孵育4 h；棄培養(yǎng)基，加入DMSO 150μL/孔，振蕩10min；待結晶物充分溶解，于酶標儀490 nm處檢測各孔光密度（D）值。

1.2.4 細胞集落形成實驗 取“1.2.1”轉染后細胞，接種于6孔板，每孔1×103個，吹打至均勻，繼續(xù)培養(yǎng)；4 d后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；直至10 d后培養(yǎng)基內肉眼可見克隆終止培養(yǎng)；4%甲醇固定約15 min；結晶紫染色10 min；洗凈并晾干。

1.2.5 細胞凋亡檢測 取“1.2.1”轉染后細胞，收集3×105個，加入100μL結合緩沖液，使細胞懸浮；順序加入5μL Annexin V及5μL PI，混勻，于室溫避光孵育15 min；加入400μL結合緩沖液，運用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 Transwell遷移實驗 取“1.2.1”轉染后細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL，分別將300μL細胞懸液和700μL含10%胎牛血清的RPMI 1640加入每個Transwell上室和下室，并于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h；取出Transwell小室，吸棄液體，醫(yī)用棉簽擦凈內部基底膜；PBS漂洗，4%低聚甲醛固定10 min；結晶紫染液染色20 min；清水漂洗，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達 用全蛋白裂解液提取待測細胞總蛋白；上樣30μg，行 SDS-PAGE；轉至 PVDF膜，TBST（含5%脫脂牛奶）封閉2 h；1×TBST洗膜4次，每次5 min；一抗波形蛋白（1∶200）、E-鈣黏蛋白（1∶250）、GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過夜；洗膜，加入相應二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h；1×TBST洗膜3次；暗室ECL發(fā)光顯色并行曝光拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，所有實驗均重復3次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LSD1在NSCLC癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

qRT-PCR檢測結果如圖1所示，與癌旁組織相比，NSCLC組織中 LSD1表達明顯增高（t＝2.861，P＜0.05）。由表1可見，LSD1表達量與NSCLC患者 TNM分期及淋巴結轉移相關（χ2＝4.062，6.047，P＜0.05），中晚期及轉移患者LSD1呈高表達，而患者年齡、性別、吸煙、腫瘤直徑、病理分型與LSD1水平未見明顯關系。

圖1 NSCLC組織和癌旁組織中LSD1 mRNA表達比較

表1 LSD1 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 例（%）

2.2 LSD1在肺癌細胞中的表達量以及si-LSD1的干擾效率

如圖2所示，LSD1在A549細胞中表達量明顯高于16HBE細胞（t＝3.569，P＜0.05）。為驗證 si-LSD1的干擾效率，在轉染48 h后，qRT-PCR檢測顯示，si-LSD1組A549細胞LSD1表達量較對照組明顯下降（t＝4.825，P＜0.05），干擾效率達 80%以上，可用于后續(xù)實驗。

圖2 qRT-PCR檢測細胞中LSD1 mRNA的表達

2.3 LSD1對A549細胞增殖能力的影響

如圖3所示，MTT實驗結果顯示，與對照組相比，在48、72、96 h時si-LSD1轉染組細胞增殖能力均較對照組低（P＜0.05），表明si-LSD1轉染組細胞增長速度受到抑制；克隆形成實驗顯示轉染si-LSD1組細胞克隆形成能力降低。由此可見，干擾A549細胞中LSD1表達后，細胞增殖能力下降。

2.4 LSD1對A549細胞凋亡的影響

流式細胞檢測分析顯示，與對照組相比，轉染si-LSD1組細胞凋亡率明顯增加（t＝3.618，P＜0.05）。由此表明，抑制LSD1表達可促進A549細胞凋亡。見圖4。

圖3 各組細胞增殖力比較

圖4 各組細胞凋亡率比較

2.5 LSD1對細胞遷移能力的影響

Transwell實驗檢測結果顯示，與對照組相比，si-LSD1轉染組細胞穿透基膜的能力明顯降低。由此說明，干擾LSD1表達后能夠明顯抑制A549細胞的遷移能力。見圖5。

圖5 Transwell實驗檢測細胞的遷移能力

2.6 LSD1對EMT相關分子的調控作用

qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，轉染 si-LSD1組上皮標志分子E-鈣黏蛋白mRNA水平上調，間質標志分子波形蛋白mRNA表達下調；蛋白質印跡法結果顯示，與對照組相比，轉染si-LSD1組E-鈣黏蛋白表達水平增加（t＝5.607，P＜0.05），波形蛋白表達降低（t＝－6.628，P＜0.05）。見圖6。綜上，LSD1可能通過調控EMT相關分子的表達，參與A549細胞增殖與遷移的調控。

圖6 EMT相關分子mRNA和蛋白的表達

3 討論

LSD1是胺氧化酶家族的重要成員，亦稱KIAA0601、AOF2、KDM1，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移中的作用已得到諸多研究者的認同[3－5]，如LSD1與腫瘤抑制基因p53相互作用，與脫乙?；笍秃衔铮∟uRD）形成LSD1/NuRD影響腫瘤的進展及侵襲的關鍵信號通路TGF-β，調節(jié)人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）等[6－8]。近來研究發(fā)現(xiàn)，LSD1介導的EMT可能通過調控轉錄因子表達及miRNA轉錄后修飾影響腫瘤的侵襲與轉移能力[12]。另有文獻證實，LSD1高表達與表皮生長因子（EGF）信號過度激活有關，活化的EGF信號通路能夠促進LSD1表達；反之，抑制LSD1表達，可阻斷EGF誘導的卵巢癌細胞增殖與遷移[13]。無疑，LSD1可能是轉移性腫瘤的一個潛在治療靶點，并提示其在腫瘤增殖與遷移中的研究價值。關于腫瘤微環(huán)境與代謝的研究進一步證實LSD1可抑制細胞線粒體呼吸、促進糖酵解途徑，從而加速食管癌細胞的代謝，增強食管癌細胞的轉移和侵襲能力，并加強其惡性生物學行為[14]。

本研究顯示在中晚期及轉移性NSCLC患者癌組織中LSD1表達增加，且與腫瘤分期及淋巴轉移相關，不僅闡明LSD1與NSCLC的惡性表型相關，也提示LSD1可能參與NSCLC細胞的增殖與轉移能力的調控。朱繼云等[12]報道LSD1通過組蛋白修飾實現(xiàn)對前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌增殖和遷移的影響。本研究進一步體外實驗結果顯示，干擾LSD1可顯著抑制細胞的增殖和遷移能力，并增加細胞凋亡率，從機制學層面證實LSD1對NSCLC增殖和遷移的影響?，F(xiàn)有文獻已證實LSD1可通過調節(jié) TGF-β1激活 ERK、NF-κB通路；調控關鍵蛋白Wnt3a的胞外分泌量來影響Wnt經(jīng)典通路；另外，LSD1可通過上調EMT的標志蛋白E-鈣黏蛋白的表達來激活其啟動子[15]。腫瘤細胞增殖和遷移受多種信號通路調控，如Wnt、NF-κB等經(jīng)典信號通路。本研究未對LSD1對信號通路中蛋白因子的作用行具體分析，其在腫瘤尤其在NSCLC中的作用和機制有待進一步研究。

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