錢堯，邵根寶，于強(qiáng)，陳波，王景文，李魯博，周洲，王品昊，李巧玉

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

惡性膠質(zhì)瘤惡性度高、侵襲性強(qiáng)，即使聯(lián)合手術(shù)、放療和化療，也無法明顯提高患者的生存率[1]。如常見的惡性星形細(xì)胞瘤，單純手術(shù)治療2年生存率為50%左右，中位生存期20～28個(gè)月[2]。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)生的、非編碼單鏈、小分子RNA[3]，其可與靶 基因 mRNA 3′-非翻譯區(qū) （3′-UTR）結(jié)合從而調(diào)控靶基因的表達(dá)；根據(jù)靶基因的種類，發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的功能，與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程密切相關(guān)[4－7]。miRNAs在多種腫瘤包括膠質(zhì)瘤中均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，部分miRNAs在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制已闡明[8]。miR-136在卵巢癌、乳腺癌及肺癌等多種腫瘤中呈低表達(dá)[9－11]。另有研究證實(shí)，miR-136在人膠質(zhì)瘤組織中也呈低表達(dá)[12－14]，其發(fā)揮的作用與不同類型的下游靶基因相關(guān)。FZD4屬于frizzled家族，與惡性腫瘤關(guān)系密切，通過信號(hào)通路參與惡性腫瘤的一系列生物學(xué)行為，包括增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等[15]。但是，miR-136在膠質(zhì)瘤中的作用及其是否參與對(duì)FZD4的調(diào)控尚不清楚。因此，本研究選擇膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系，上調(diào)miR-136的表達(dá)，分析FZD4的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM、PBS、胰蛋白酶為美國(guó) Hyclone公司產(chǎn)品。胎牛血清購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司。miR-136模擬物序列：5′-ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGA-3′，陰性對(duì)照序列：5′-GUCCCACUUCGACCGUGCUUCCA-3′，由廣州銳博生物有限公司構(gòu)建。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒、蛋白裂解液RIPA均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。CCK-8購(gòu)自北京Sigma公司。FZD4兔抗人單克隆抗體、內(nèi)參GAPDH抗體為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。miR-136、FZD4及內(nèi)參U6引物由上海生工生物工程有限公司合成。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物試劑有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d胰酶消化U251細(xì)胞并計(jì)數(shù)，接種于6孔板中，分為2組。當(dāng)細(xì)胞密度接近90%時(shí)，利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染miR-136模擬物（50 nmol/L，模擬物組）及 miR-136模擬物陰性對(duì)照（50 nmol/L，對(duì)照組）。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè) U251細(xì)胞 miR-136和FZD4 mRNA的表達(dá)

取“1.3”轉(zhuǎn)染后的2組細(xì)胞，參照Trizol試劑盒說明書分別提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度及純度[D（260 nm）/D（280 nm）在1.8～2.0之間]。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR-136反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCAT-3′。反應(yīng)體系 10μL，反應(yīng)條件：42℃60 min；70℃10 min，1個(gè)循環(huán)。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行定量PCR，miR-136引物序列：上游5′-GCGCACTCCATTTGTTTTGAT-3′；下 游 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。FZD4引物序列：上游 5′-AAACTAGCGGCCGCTAGTTCAGTTACCAGTGACCTTCAT-3′；下游 5′-CTAGATGAAGGTCACTGGTAACTGAACTAGCGGCCGCTAGTTT-3′；以 U6為 內(nèi) 參。PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)體系20μL，90℃30 s；95℃5 s，60℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)。以 2－ΔΔCt值計(jì)算 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取“1.3”轉(zhuǎn)染后2組細(xì)胞，胰酶消化，接種于6孔板中（細(xì)胞計(jì)數(shù)1×105個(gè)/孔），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；待細(xì)胞完全貼壁后顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，拍照記錄，記為“0 h”，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察并拍照記錄，記為“24 h”。

取“1.3”轉(zhuǎn)染后2組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，并接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)72 h，每24 h加入10μL CCK-8試劑，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，測(cè)各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的光密度（D）值。

1.6 Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)

采用Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。取“1.3”轉(zhuǎn)染后的2組U251細(xì)胞，胰酶消化、離心，棄上清液，重懸于無血清培養(yǎng)基中；再將細(xì)胞置于含有Matrigel侵襲室內(nèi)，在下室中加入有血清的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)；次日用4%低聚甲醛室溫固定30 min；結(jié)晶紫染色15 min；棄小室內(nèi)液體，用棉簽輕輕擦干，并置于顯微鏡下拍照。

采用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。將2組細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日觀察細(xì)胞，待鋪滿培養(yǎng)板后，用200μL槍頭垂直畫線，形成間隙。PBS重復(fù)洗3遍，再加入不含血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別于0 h、24 h顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 miR-136靶基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

檢索 miRnada[16]生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫根據(jù)信息提示，預(yù)測(cè)并分析miR-136的下游靶基因。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)U251細(xì)胞中FZD4蛋白的表達(dá)

取“1.3”轉(zhuǎn)染后2組細(xì)胞，按照RIPA說明書分別提取總蛋白；100℃水浴15min使蛋白充分變性；行SDS-PAGE，每孔上樣量15μL；110 V電泳1 h；300 mA恒流，90 min轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%封閉液（2 g脫脂奶粉溶于40 mL TBST溶液）于4℃封閉4 h；TBST緩沖液搖床振蕩洗膜3次，每次2 min；加入抗FZD4單抗及內(nèi)參GAPDH抗體（均1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；次日TBST緩沖液搖床漂洗3次，每次10 min；加入二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次10 min；將超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒A液和B液按1∶1混合，均勻加至PVDF膜，室溫避光孵育2 min；置于自動(dòng)顯影儀器進(jìn)行目的蛋白顯影，采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間均數(shù)比較采用Student′st檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-136的轉(zhuǎn)染效率

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模擬物組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miR-136的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.05，P＜0.05）。見圖1。

圖1 U251細(xì)胞中m iR-136的表達(dá)

2.2 miR-136對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

鏡下觀察結(jié)果顯示，在0 h時(shí)模擬物組和對(duì)照組細(xì)胞密度無明顯差異，轉(zhuǎn)染24 h之后模擬物組細(xì)胞密度明顯低于對(duì)照組，說明miR-136可抑制U251細(xì)胞生長(zhǎng)。見圖2。

圖2 U251細(xì)胞的生長(zhǎng)密度（×400）

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，在24，48，72 h時(shí)模擬物組D值均低于對(duì)照組（P＜0.05），尤其在24～48 h模擬物組細(xì)胞增殖非常緩慢，基本停止增殖，表明miR-136可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖活性。見圖3。

圖3 CCK-8檢測(cè)U251細(xì)胞增殖力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后模擬物組U251細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組，說明miR-136可抑制U251細(xì)胞侵襲。見圖4。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力（×200）

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后模擬物組U251細(xì)胞遷移距離明顯小于對(duì)照組，表明miR-136可抑制U251細(xì)胞的遷移。見圖5。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力（×40）

2.3 miR-136靶基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

利用miRnada數(shù)據(jù)庫分析miR-136的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FZD4可能是其下游靶基因。miR-136與FZD4 mRNA 3′-UTR結(jié)合區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果見圖6。

圖6 靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)FZD4為m iR-136下游靶基因

2.4 轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞中FZD4 mRNA和蛋白的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，模擬物組中FZD4 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（t＝5.878，P＜0.05），說明miR-136抑制FZD4 mRNA表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，模擬物組FZD4蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。由此表明，miR-136抑制FZD4蛋白表達(dá)。見圖7。

3 討論

miRNA在大小、結(jié)構(gòu)和功能方面存在著高度的保守性，組成了物種進(jìn)化過程中細(xì)胞高度復(fù)雜的RNA表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[17]，參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等一系列關(guān)鍵進(jìn)程。邢亞楠等[18]報(bào)道證實(shí)，抑制miR-136表達(dá)可促進(jìn)PPP2R2A蛋白表達(dá)，進(jìn)而引起胃癌細(xì)胞凋亡。因此，miR-136功能失調(diào)可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-136表達(dá)可明顯抑制U251細(xì)胞的生物學(xué)活性，從而證實(shí)miR-136在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著類似抑癌基因的功能。

圖7 m iR-136轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞FZD4 mRNA和蛋白的表達(dá)

FZD4是wnt信號(hào)通路中重要的下游基因，參與細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡等多種生物學(xué)過程[19]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)ZD4參與多種惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著類似癌基因的作用，如在膀胱癌、肺癌及宮頸癌等癌組織中均呈高表達(dá)，且其高表達(dá)水平與腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)[16，20－21]。本研究通過miRnada生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)FZD4 mRNA 3′-UTR存在miR-136的靶向結(jié)合位點(diǎn)。因此，我們推測(cè)FZD4可能為miR-136的靶基因之一，miR-136與FZD4之間可能存在靶向調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-136可明顯降低FZD4 mRNA及蛋白表達(dá)，因此證實(shí) miR-136可負(fù)向調(diào)控FZD4的表達(dá)，從而抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。但是本研究只證實(shí)上調(diào)miR-136可抑制FZD4的表達(dá)，尚未闡述miR-136靶向調(diào)控FZD4的具體作用機(jī)制，以及FZD4是否參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的其他過程（如U251細(xì)胞凋亡）與預(yù)后的關(guān)系等，還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miR-136可能通過下調(diào)FZD4的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，提示miR-136、FZD4可作為臨床治療膠質(zhì)瘤的潛在標(biāo)志物。

[1]Wang X，Jia Y，Wang P，et al.Current status and future perspectives of sonodynamic therapy in glioma treatment[J].Ultrason Sonochem，2017，37：592－599.

[2]Siegel RL，Miller KD，Jemal A，et al.Cancer Statistics，2017[J].CA Cancer JClin，2017，67（1）：7－30.

[3]高佳莉，羅玉萍，李思光.miR-34基因家族的分子進(jìn)化[J].動(dòng)物學(xué)研究，2007，28（3）：271－278.

[4]Piva R，Spandidos DA，Gambari R，et al.From microRNA functions tomicroRNA therapeutics：novel targets and novel drugs in breast cancer research and treatment（Review）[J].Int JOncol，2013，43（4）：985－994.

[5]Luna-Aguirre CM，de la Luz Martinez-Fierro M，Mar-Aguilar F，et al.Circulating microRNA expression profile in B-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Cancer Biomark，2015，15（3）：299－310.

[6]Sampson VB，Yoo S，Kumar A，et al.MicroRNAs and potential targets in osteosarcoma：review[J].Front Pediatr，2015，3：69.

[7]Kanda M，Kodera Y.Recent advances in themolecular diagnostics of gastric cancer[J].World JGastroenterol，2015，21（34）：9838－9852.

[8]Yang L，Mu Y，Cui H，et al.miR-9-3p augments apoptosis induced by H2O2through down regulation of Herpud1 in glioma[J]. PLoS One， 2017， 12（4）：e0174839.

[9]Zhao H，Liu S，Wang G，et al.Expression ofmiR-136 is associated with the primary cisplatin resistance of human epithelial ovarian cancer[J].Oncol Rep，2015，33（2）：591－598.

[10]Yan M，Li X，Tong D，et al.miR-136 suppresses tumor invasion and metastasis by targeting RASAL2 in triple-negative breast cancer[J].Oncol Rep，2016，36（1）：65－71.

[11]Yang Y，Liu L，Cai J，et al.Targeting Smad2 and Smad3 by miR-136 suppresses metastasis-associated traits of lung adenocarcinoma cells[J].Oncol Res，2013，21（6）：345－352.

[12]Wu H，Liu Q，Cai T，et al.MiR-136 modulates glioma cell sensitivity to temozolomide by targeting astrocyte elevated gene-1[J].Diagn Pathol，2014，9：173.

[13]Yang Y，Wu J，Guan H，et al.MiR-136 promotes apoptosis of glioma cells by targeting AEG-1 and Bcl-2[J].FEBS Lett，2012，586（20）：3608－3612.

[14]Chen W，Yang Y，Li Q，et al.MiR-136 targets E2F1 to reverse cisplatin chemosensitivity in glioma cells[J].JNeurooncol，2014，120（1）：43－53.

[15]Ueno K，Hirata H，Majid S，et al.Tumor suppressor microRNA-493 decreases cellmotility and migration ability in human bladder cancer cells by downregulating RhoC and FZD4[J].Mol Cancer Ther，2012，11（1）：244－253.

[16]John B，Enright AJ，Aravin A，et al.Human MicroRNA targets[J].PLoSBiol，2004，2（11）：e363.

[17]戴中華，陳良標(biāo).MicroRNA對(duì)多細(xì)胞動(dòng)物復(fù)雜性進(jìn)化的影響[J].遺傳，2010，32（2）：105－114.

[18]邢亞楠，鄧鵬，徐惠綿.miR-136通過抑制PPP2R2A表達(dá)調(diào)控胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡[J].臨床與病理雜志，2015，35（12）：2108－2111.

[19]Gupta S，Iljin K，Sara H，et al.FZD4 as amediator of ERG oncogene-induced WNT signaling and epithelial-tomesenchymal transition in human prostate cancer cells[J].Cancer Res，2010，70（17）：6735－6745.

[20]Lin J，Zandi R，Shao R，et al.A miR-SNP biomarker linked to an increased lung cancer survival by miRNA-mediated down-regulation of FZD4 expression and Wnt signaling[J].Sci Rep，2017，7（1）：9029.

[21]Ma C，Xu B，Husaiyin S，et al.MicroRNA-505 predicts prognosis and acts as tumor inhibitor in cervical carcinoma with inverse association with FZD4[J].Biomed Pharmacother，2017，92：586－594.