吳杏兒，趙麗輝，陳應(yīng)智，孫世珺

（中山市人民醫(yī)院1.分子診斷中心，2.病理科，廣東 中山528403）

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）及其受體激動劑 Exendin-4（Exd-4）作為糖尿病治療藥物，對2型糖尿病患者具有刺激葡萄糖依賴的胰島素分泌、減少胰島β細(xì)胞凋亡及促進(jìn)β細(xì)胞增殖等作用[1]。Exd-4與多個參與調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能的細(xì)胞內(nèi)信號通路相互作用，其中包括Wnt信號通路。Wnt信號通路在細(xì)胞增殖、存活、遷移及分化等過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2－3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Exd-4可通過調(diào)控如Wnt4等Wnt信號通路配體基因表達(dá)，影響β細(xì)胞增殖[4]。這種現(xiàn)象提示W(wǎng)nt配體可能是介導(dǎo)Exd-4調(diào)節(jié)β細(xì)胞增殖活性的重要蛋白分子。Wnt5a是人類及大鼠Wnt配體家族的重要成員，在胰腺組織中基礎(chǔ)表達(dá)豐度高，對脊椎動物胚胎發(fā)育過程中胰島形成起重要作用。本實驗通過研究Exd-4對大鼠胰島β細(xì)胞瘤INS-1細(xì)胞中Wnt5a基因表達(dá)的調(diào)控，探討Exd-4調(diào)控β細(xì)胞增殖的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠胰島 β細(xì)胞瘤 INS-1細(xì)胞（ATCC細(xì)胞庫）。小牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Exd-4、2-巰基乙醇、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、二甲亞砜（美國Sigma公司）；siRNA由廣州吉捷生物科技有限公司合成提供（包括無意義序列、序列1、序列2和序列3）；重組人/鼠Wnt5a蛋白（美國R＆D system公司）；EdU試劑盒購自銳博生物技術(shù)公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000、PCR引物（美國Invitrogen公司）；兔抗鼠Wnt5a抗體、兔抗鼠GAPDH抗體（美國Cell Signal Technology公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記IgG購自杭州弗德生物技術(shù)有限公司；Eastep通用型總RNA提取試劑盒、GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、GoTaq?qPCR Master Mix（美國 Promaga公司）。

熒光定量PCR儀7500（ABI公司）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將大鼠胰島β細(xì)胞瘤INS-1細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱，每100 mL細(xì)胞培養(yǎng)液含有10%

小牛血清、1%青-鏈霉素雙抗、1%2-巰基乙醇35 μL、碳酸氫鈉 0.2 g、10μmol/L HEPES 0.1 mL。以含0.25%胰酶消化細(xì)胞傳代，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液。

1.3 Edu標(biāo)記染色法檢測INS-1細(xì)胞增殖率

1.3.1 細(xì)胞分組 Exd-4刺激細(xì)胞實驗中細(xì)胞分8組：PBS溶劑對照組以及 1、5、10、25、50、75及 100 nmol/L共7個濃度Exd-4處理組。共培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞染色計數(shù)。

Exd-4及重組Wnt5a蛋白共培養(yǎng)實驗中細(xì)胞分6組：50 nmol/L Exd-4處理組，50 nmol/L Exd-4＋重組 Wnt5a蛋白5種濃度（50、100、250、500、1 000 ng/mL）共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞染色計數(shù)。

1.3.2 細(xì)胞染色 細(xì)胞以 4×104/孔密度種植至鋪有蓋玻片的24孔板，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)染或共培養(yǎng)，離觀察終點(diǎn)2 h前往培養(yǎng)基中加入EdU溶液（終濃度為50μmol/L），按試劑盒說明固定細(xì)胞、染色及鋪片。

1.3.3 倒置顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞增殖率 觀察Appolo567染色使用550 nm激發(fā)光，觀察Hoechst3342染色使用350 nm激發(fā)光（放大倍數(shù)為400×）。每復(fù)孔等分4象限，每象限隨機(jī)拍攝3張不同視野照片并計數(shù)，分別計算Hoechst（細(xì)胞核）及Appolo（增殖細(xì)胞）染色細(xì)胞數(shù)，Appolo/Hoechst比值為細(xì)胞增殖率，每復(fù)孔Hoechst染色陽性細(xì)胞計數(shù) ＞1 000個。同組設(shè)3個復(fù)孔，取增殖率平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將INS-1細(xì)胞分為4組：無意義siRNA轉(zhuǎn)染組，Wnt5a-siRNA-1轉(zhuǎn)染組，Wnt5a-siRNA-2轉(zhuǎn)染組和Wnt5a-siRNA-3轉(zhuǎn)染組。按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，分別將含有1μg無意義siRNA，Wnt5a-siRNA-1（上游：5′-CAAGGAAUUCGUGGACGCACGAGAAdTd-3′，下游：5′-UUCUCGUGCGUCCACGAAUUCCUUGdTd-3′），Wnt5a-siRNA-2（上游：5′-GCAUCCUCAUGAACUUGCACAACAAdTd-3′，下游：5′-UUGUUGUGCAAGUUCAUGAGGAUGCdTd-3′）及 Wnt5a-siRNA-3（上 游：5′-GGACAGUAUACAACCUGGCAGAUGUdTd-3′，下游：5′-ACAUCUGCCAGGUUGUAUACUGUCCdTd-3′）稀釋液加入含無血清培養(yǎng)基的EP管中混勻，緩慢加入到含1μL LipofectamineTM2000的50μL無血清培養(yǎng)基中，混勻后室溫靜置20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。使用轉(zhuǎn)染復(fù)合物培養(yǎng)INS-1細(xì)胞6～8 h后吸出轉(zhuǎn)染復(fù)合物，換含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，總培養(yǎng)時間為36 h。收集細(xì)胞用于蛋白印跡檢測或EdU標(biāo)記染色進(jìn)行細(xì)胞增殖率計數(shù)。

1.5 半定量 RT-PCR檢測 INS-1細(xì)胞 Wnt5a的表達(dá)

將細(xì)胞分為3組：PBS溶劑對照組、50 nmol/L Exd-4處理細(xì)胞12 h組和24 h組。按試劑盒說明柱提法冰面操作提取對數(shù)生長期細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：25℃退火5 min，延伸1 h，70℃滅活15 min。cDNA樣本－20℃保存?zhèn)溆?。RTPCR反應(yīng)總體系為20μL，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物樣本5 μL，無酶核酸水4μL，引物0.8μL，Master Mix2×10 μL，CXR100×0.2μL。反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃15 s后60℃1 min（40個循環(huán)）。

采用2－△△Ct方法計算Wnt5a相對表達(dá)量，內(nèi)標(biāo)基因為 β-肌動蛋白。ΔΔCt＝實驗組（Ct目的基因－Ct管家基因）－對照組（Ct目的基因－Ct管家基因）。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測INS-1細(xì)胞Wnt5a的表達(dá)

將INS-1細(xì)胞分為6組，對照組加入PBS，其余5組分別采用 50 nmol/L Exd-4處理 1、3、6、12、24 h。至觀察終點(diǎn)棄去培養(yǎng)基加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。12%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，4%BSA封閉2 h，TBST洗膜3次后加兔抗Wnt-5a一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，洗膜3次加二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜后再在暗室中加入發(fā)光劑，顯影后定影。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件灰度掃描圖像檢測Wnt5a蛋白的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

每組設(shè)置3次重復(fù)獨(dú)立實驗，每個處理組至少重復(fù)3個復(fù)孔，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析或t檢驗，置信區(qū)間為95%，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Exd-4對INS-1細(xì)胞增殖的影響

使用不同濃度的Exd-4處理INS-1細(xì)胞24 h后，EdU標(biāo)記染色實驗顯示，Exd-4呈濃度依賴性促進(jìn)INS-1細(xì)胞增殖。與 PBS組比較，自10 nmol/L濃度起Exd-4能顯著提高INS-1細(xì)胞增殖率（均P＜0.01）；50 nmol/L Exd-4促進(jìn) INS-1增殖達(dá)最大效應(yīng)。見圖1。

圖1 不同濃度Exd-4對INS-1細(xì)胞增殖率的影響

2.2 Exd-4下調(diào)INS-1細(xì)胞中Wnt5a基因的表達(dá)

半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Exd-4處理12 h、24 h后，INS-1細(xì)胞Wnt5amRNA轉(zhuǎn)錄水平比PBS對照組顯著下降（均P＜0.05）。見圖2。使用50 nmol/L Exd-4刺激細(xì)胞進(jìn)行時間梯度實驗，蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，經(jīng)Edx-4處理6 h后細(xì)胞Wnt5a蛋白水平顯著下降（均P＜0.01）。見圖3。

圖2 Exd-4處理后INS-1細(xì)胞中W nt5a mRNA的表達(dá)

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測經(jīng)Exd-4處理不同時間后INS-1中W nt5a蛋白水平

2.3 Wnt5a對INS-1細(xì)胞增殖的影響

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，3種不同序列siRNA-Wnt5a均能有效沉默INS-1中Wnt5a基因表達(dá)（圖4）。EdU標(biāo)記染色法檢測結(jié)果顯示，與無意義siRNA轉(zhuǎn)染組比較，siRNA沉默Wnt5a后細(xì)胞增殖率明顯升高（P＜0.01）。見圖5。上述結(jié)果表明，基礎(chǔ)狀態(tài)下Wnt5a是抑制INS-1細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子。

圖4 蛋白質(zhì)印跡檢測經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后各組INS-1細(xì)胞W nt5A的表達(dá)

圖5 EdU標(biāo)記法檢測siRNA沉默Wnt5a基因后INS-1細(xì)胞增殖率

2.4 Wnt5a介導(dǎo)Exd-4調(diào)控INS-1細(xì)胞增殖

培養(yǎng)基中加入不同濃度重組Wnt5a蛋白與50 nmol/L Exd-4共培養(yǎng)，EdU標(biāo)記染色法檢測結(jié)果顯示，與不加Exd-4組比較，加入各種濃度Exd-4均能明顯降低INS-1細(xì)胞增殖率（均P＜0.01），且呈濃度依賴性。說明重組Wnt5a蛋白呈濃度依賴性拮抗Exd-4對INS-1細(xì)胞的促增殖作用。見圖6。

圖6 EdU標(biāo)記法檢測不同濃度重組W nt5a蛋白對Exd-4誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖影響

3 討論

Exd-4作為GLP-1受體長效激動劑，已被體內(nèi)外實驗證實具有促β細(xì)胞增殖效應(yīng)[5]。GLP-1及Exd-4可通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典Wnt信號通路影響細(xì)胞增殖。Exd-4與細(xì)胞膜上GLP-1受體結(jié)合后引起胞內(nèi) cAMP聚集，激活 cAMP依賴蛋白激酶 A（cAMP-dependent protein kinase A，PKA），PKA對β-catenin第675位絲氨酸殘基進(jìn)行磷酸化修飾，使胞質(zhì)β-catenin穩(wěn)定性增加，更多β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與TCF7L2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成具有轉(zhuǎn)錄活性的復(fù)合體，調(diào)節(jié)下游有關(guān)細(xì)胞周期的靶基因表達(dá)，促進(jìn) β細(xì)胞增殖[6]。

遺傳高度保守的Wnt信號通路對胚胎及出生后胰島β細(xì)胞的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)都有重要的作用[7－8]，該通路的信號分子在胰島β細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)[9]。然而，既往關(guān)于 GLP-1/Exd-4與Wnt信號通路的研究，焦點(diǎn)多集中于Exd-4對該通路受體水平以下的信號調(diào)節(jié)，至于Exd-4能否調(diào)控Wnt信號通路源頭——第一信號分子的Wnt配體表達(dá)，目前鮮有報道。

Wnt基因家族編碼一系列富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，目前已知鼠及人類Wnt基因家族有19個成員，Wnt蛋白通過自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌等方式與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，不同的Wnt亞型對細(xì)胞的生物學(xué)行為起不同的效應(yīng)[10]。相關(guān)研究顯示，在小鼠及斑馬魚等動物胚胎模型中，Wnt5a及其相應(yīng)受體（如Frizzled-2）在胰島中廣泛表達(dá)；對小鼠胚胎過表達(dá)Wnt5a cDNA，觀察到胰島組織較對照組縮小；以嗎啉基下調(diào)斑馬魚胚胎中Wnt5a基因表達(dá)后，分泌胰島素的細(xì)胞遷移受到影響，與對照組形成的典型胰島結(jié)構(gòu)相比，Wnt5a低表達(dá)導(dǎo)致多個較小的細(xì)胞島形成[11]。這些實驗說明Wnt5a可能對胰島及β細(xì)胞的發(fā)育遷移起重要作用。至于Wnt5a對胰島β細(xì)胞增殖起何作用，Wnt5a能否介導(dǎo)Exd-4調(diào)控β細(xì)胞增殖，目前尚無文獻(xiàn)報道。

本研究結(jié)果顯示，GLP-1受體長效激動劑Exd-4促進(jìn)大鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞系INS-1增殖，并同時抑制Wnt5a基因表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默Wnt5a基因并觀察細(xì)胞增殖率變化，證實Wnt5a是抑制大鼠β細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子。本研究進(jìn)一步在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入鼠/人重組Wnt5a蛋白與Exd-4進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Wnt5a重組蛋白可有效拮抗Exd-4引起的促INS-1細(xì)胞增殖效應(yīng)。上述結(jié)果提示Exd-4可能通過調(diào)控Wnt5a表達(dá)影響β細(xì)胞增殖。

目前，尚無研究揭示Exd-4調(diào)控Wnt5a基因表達(dá)的具體機(jī)制。如前述，Exd-4與GLP-1受體結(jié)合后通過聚集cAMP激活PKA，有研究指出PKA激活后可抑制TGF-β對下游通路信號分子的誘導(dǎo)表達(dá)[12]。在乳腺癌細(xì)胞中，TGF-β通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子CUTL1而進(jìn)一步調(diào)控其下游的Wnt5a基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力[13]。也有報道稱Exd-4可下調(diào)db/db小鼠腎臟及人間充質(zhì)干細(xì)胞中 TGF-β1的表達(dá)[6，14]。故此推測胰島β細(xì)胞中的Exd-4可能通過激活GLP-1受體后抑制TGF-β，從而調(diào)控Wnt5a基因表達(dá)。但確切的機(jī)制還需進(jìn)一步的實驗證實。

本研究發(fā)現(xiàn)Wnt5a可抑制大鼠β細(xì)胞瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖，并拮抗Exd-4對INS-1細(xì)胞的促增殖作用。已有大量研究證實，Exd-4/GLP-1受體通過激活PKA促進(jìn)β-catenin入核，促進(jìn)下游如Cyclin D1等細(xì)胞周期因子轉(zhuǎn)錄[6]。Wnt5a可通過激活CaMKⅡ下調(diào)Cyclin D1表達(dá)，從而抑制小鼠B淋巴細(xì)胞增殖[15]。此外，另有研究顯示 Wnt5a可降低β-catenin穩(wěn)定性，抑制與DNA結(jié)合的T細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄活性從而拮抗經(jīng)典Wnt信號通路[16]。目前非經(jīng)典Wnt通路配體Wnt5a調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖的通路機(jī)制尚有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探索。

綜上所述，本項研究結(jié)果顯示，Exendin-4通過下調(diào)Wnt5a基因表達(dá)，促進(jìn)大鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。該結(jié)果提示W(wǎng)nt5a可能是調(diào)節(jié)β細(xì)胞數(shù)量的重要因子。但Exendin-4調(diào)控Wnt5a基因表達(dá)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究揭示。

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