張松 袁佛良 吳淑獻(xiàn) 熊武 余坤飛 康喜訊 姜軍合

近來(lái)許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn), 鼻咽癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與多種基因有關(guān), 例如一些抑癌基因的失活及原癌基因的激活可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移。MicroRNA-335是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種MicroRNA, 最近研究發(fā)現(xiàn)它與多種腫瘤密切相關(guān)。Sun等［1］研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-335抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。Jiang等［2］認(rèn)為MicroRNA-335的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤差的預(yù)后有關(guān)。本研究探討了MicroRNA-335表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲的調(diào)控作用, 具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 本研究中CNE 2細(xì)胞為鼻咽部低分化癌培養(yǎng)建系而來(lái), 在1640培養(yǎng)基, 含適量10%胎牛血清、37℃、二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合80%左右時(shí)用胰蛋白酶消化后分離CNE 2細(xì)胞, 然后分成6等份, 分別接種在六孔板的孔中, 將6孔隨機(jī)分為兩組, 每組3孔。培養(yǎng)24 h后,一組用5-雜氮-2脫氧胞苷處置, 另一組不加任何藥物作,24 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng), 再過(guò)24 h加胰酶消化, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 甲基化特異性聚合酶鏈法(MSP) 將上述兩組細(xì)胞提取DNA, 進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾, 再用甲基化和非甲基化兩組引物對(duì)修飾過(guò)的DNA分別擴(kuò)增。甲基化引物序列(M)：F: TTTGTATTGTGATTTTATTTTACGT, R: AACAAATTTCC TTTACAA CAACG, 非甲基化引物(U)：F：TTTGTATTGTGA TTTTATTTTATGT, R: AAACAAATTTCCTTTA CAACAACAC［3］。分別取上述兩組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物5 μl用1%瓊脂糖凝膠電泳, 觀察MicroRNA335基因甲基化情況。

1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 提取上述兩組細(xì)胞的總RNA, 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄形成DNA第一鏈(cDNA), 然后行常規(guī)PCR。MicroRNA335引物：TCAAGAGCAATAACGAAAAA TGT(F), GCTGTCAACGATACGC TACGT(R)；U6 引物: CTCGCTT CGGCAGCACA (F), AACGCTTCACGAATTTGCGT(R)。反應(yīng)結(jié)束后取每組PCR產(chǎn)物5 μl用1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 觀察MicroRNA335表達(dá)情況。

1.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell小室法) 將上述兩組細(xì)胞分別消化制成105個(gè)/ml懸液, 離心后, 棄上清, 加入200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基, 吹勻后放入Transwell小室中。將小室放入含10% 胎牛血清(FBS) 1640的培養(yǎng)基Transwell板中。在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室, 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗去培養(yǎng)基, 用結(jié)晶紫染色10 min, 自來(lái)水洗除干凈表面的結(jié)晶紫,用棉簽擦除干凈上室中的細(xì)胞, 用倒置顯微鏡觀察侵襲細(xì)胞數(shù), 隨機(jī)取10個(gè)視野記錄每組細(xì)胞數(shù), 分析5-雜氮-2-脫氧胞苷對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲基化特異性PCR結(jié)果 未經(jīng)5-雜氮-2-脫氧胞苷處理的CNE 2細(xì)胞中MicroRNA335基因是甲基化的, 而經(jīng)過(guò)5-雜氮-2脫氧胞苷處理的CNE 2細(xì)胞中MicroRNA335基因是非甲基化的。

2.2 RT-PCR結(jié)果 在未經(jīng)5-雜氮-2脫氧胞苷處理的CNE 2細(xì)胞中MicroRNA335不表達(dá), 而在經(jīng)過(guò)5-雜氮-2脫氧胞苷處理的CNE 2細(xì)胞中MicroRNA335高表達(dá)。

2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5-雜氮-2脫氧胞苷處理前的CNE 2細(xì)胞侵襲數(shù)(14.32±2.36)明顯多于5-雜氮-2脫氧胞苷處理后的CNE 2細(xì)胞侵襲數(shù)(7.80±1.24)(t=6.373, P＜0.01)。

3 討論

MicroRNA-335是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種MicroRNA, 它可與靶基因mRNA結(jié)合后導(dǎo)致其降解, 對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等過(guò)程中起重要作用。近來(lái)學(xué)者們發(fā)現(xiàn)MicroRNA-335與多種腫瘤密切相關(guān)。Shu等［4］發(fā)現(xiàn)MicroRNA-335抑制惡性星形細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)及侵襲。Li等［5］發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)可調(diào)控MicroRNA-335表達(dá)。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種遺傳方式, 表觀遺傳學(xué)是指基因的序列不發(fā)生變化, 而通過(guò)基因的修飾改變其表達(dá)狀態(tài), 常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)方式有DNA甲基化、組蛋白乙?；?、小干擾RNA等。近年來(lái), DNA甲基化已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn), 學(xué)者們已經(jīng)通過(guò)改變多種抑癌基因的甲基化方式來(lái)改變其表達(dá), 進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在喉癌和鼻咽癌中死亡相關(guān)蛋白激酶基因的失活與其基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化有關(guān), 用5-雜氮-2-脫氧胞苷去甲基化后死亡相關(guān)蛋白激酶基因重新激活, 癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及侵襲能力被抑制［6-8］。本研究用5-雜氮-2脫氧胞苷處理鼻咽癌細(xì)胞CNE 2, 使因甲基化狀態(tài)失活的MicroRNA-335基因去甲基化而重新表達(dá), 而鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。

綜上所述, 在鼻咽癌細(xì)胞中5-雜氮-2-脫氧胞苷可以使甲基化的MicroRNA-335基因去甲基化而重新表達(dá), 說(shuō)明MicroRNA-335的表達(dá)是受其基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)調(diào)控的?；蛉ゼ谆驧icroRNA-335重新表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞較未處理的細(xì)胞侵襲能力明顯減弱, 說(shuō)明MicroRNA-335表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲有抑制作用。MicroRNA-335可能成為鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)。

［1］Sun Z, Zhang Z, Liu Z, et al.MicroRNA-335 inhibits invasion and metastasis of colorectal cancer by targeting ZEB2.Med Oncol, 2014,31(6):1-10.

［2］Jiang J, Sun X, Wang W, et al.Tumor microRNA-335 expression is associated with poor prognosis in human glioma.Medical Oncology,2012, 29(5):3472-3477.

［3］王鶴 , 劉志利 , 德偉, 等.microRNA-335對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移、侵襲及增殖能力的影響.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012(6):795-799.

［4］Shu M, Zhou Y , Zhu W , et al.MicroRNA 335 is required for differentiation of malignant glioma cells induced by activation of cAMP/protein kinase A pathway.Molecular Pharmacology, 2012,81(3):292.

［5］Li Z , Li D , Zhang G , et al.Methylation-associated silencing of MicroRNA-335 contributes tumor cell invasion and migration by interacting with RASA1 in gastric cancer.American Journal of Cancer Research, 2014, 4(6):648-662.

［6］劉付梅.MicroRNA--150調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的研究.廣東醫(yī)學(xué)院 , 2014.

［7］張配.MicroRNA調(diào)控上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響.蚌埠醫(yī)學(xué)院 , 2014.

［8］何威.生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程中的mRNA-microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò).中南大學(xué) , 2012.