孫嘉婧，劉勇，馬巖，馬偉*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)管理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028)

腎病綜合征(nephritic syndrome,NS)是由多種腎臟疾病導(dǎo)致腎臟基底膜的通透性增加，以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥為該病狀的主要特征，病程很長并且容易反復(fù)發(fā)作[1]。阿霉素能夠損傷腎細(xì)胞，能從DNA分子水平上直接干預(yù)足突細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，造成足突細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變[2]。用藥幾天就可以導(dǎo)致腎臟發(fā)生嚴(yán)重的損傷是阿霉素腎病的模型主要特征，并且時(shí)段穩(wěn)定、能夠預(yù)料且死亡率低[3]。該模型和人類的慢性蛋白尿腎臟疾病非常類似，同時(shí)該模型在大鼠和小鼠上情況也十分接近[4]，因此已被廣泛使用[5-6]。有研究表明，SD大鼠、Wistar大鼠及BALB/c小鼠對造模藥物非常敏感，且具有出現(xiàn)模型相應(yīng)特征迅速持續(xù)與穩(wěn)定的特點(diǎn)，并且這幾種動(dòng)物易于培養(yǎng)，生存能力又強(qiáng)，在阿霉素腎病模型中被廣泛使用[7-9]。

在腎病治療領(lǐng)域中，細(xì)胞毒性藥物、糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑為目前采用的主要治療藥物[10]。但是這幾種治療藥物通常具有很大毒副作用，并且該方法療程很長，不良反應(yīng)偏多。本實(shí)驗(yàn)選擇由半邊蓮、半枝蓮及白花蛇舌草三種藥材組成的復(fù)方半邊蓮注射液為研究對象，其通常多用于多發(fā)性癤腫，扁桃體炎以及乳腺炎等相關(guān)疾病治療，也作為腫瘤化療用藥[11]。近年來有相關(guān)文獻(xiàn)研究表明，復(fù)方半邊蓮注射液對小兒支氣管炎、肺炎、腹瀉以及成人呼吸道感染均有很好的治療作用[12-13]，但是暫未發(fā)現(xiàn)其對腎病的相關(guān)治療作用報(bào)道。通過對其在阿霉素腎病模型的藥效學(xué)作用分析，能夠?yàn)樵搹?fù)方在后續(xù)臨床研究中的應(yīng)用提供新的思路。

1 儀器與試劑

全自動(dòng)生化儀(日本日立公司)；代謝籠(安徽正華生物儀器設(shè)備)；復(fù)方半邊蓮注射液(160901，河南同源制藥公司)；注射用還原型谷胱甘肽(16232360，重慶藥友制藥公司)；水合氯醛(上海鼓臣生物)；尿蛋白試紙(20160702，廣州市珠江生化試劑)；注射用鹽酸多柔比星(16000311，海正輝瑞制藥)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4～6周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，48只，采購于青島大任富城畜牧公司(scxk魯2014.0001，青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究院動(dòng)物房，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，室溫21～23℃，濕度55%～65%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，每日大鼠進(jìn)食前觀察大鼠精神狀態(tài)，并且每周稱量一次體質(zhì)量。

于實(shí)驗(yàn)前，以尿蛋白試紙測定各大鼠尿蛋白情況，確定測定結(jié)果為陰性后，按照各分組情況進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，分組情況如下：

空白組：大鼠經(jīng)尾靜脈一次性注射等量鹽酸阿霉素生理鹽水,其他組2周造模結(jié)束后，按中劑量組劑量每日給予等量蒸餾水腹腔注射。

模型組：大鼠經(jīng)尾靜脈一次性注射鹽酸阿霉素的給藥劑量為6.5 mg/kg，期間自由飲水進(jìn)食，2周后造模完成，按中劑量組劑量每日給予等量蒸餾水腹腔注射。

復(fù)方半邊蓮注射液低劑量組：同模型組造模后，大鼠每日腹腔注射復(fù)方半邊蓮注射液0.417 ml/kg，連續(xù)給藥3周。

復(fù)方半邊蓮注射液中劑量組：同模型組造模后，大鼠每日腹腔注射復(fù)方半邊蓮注射液0.834 ml/kg，連續(xù)給藥3周。

復(fù)方半邊蓮注射液高劑量組：同模型組造模后，大鼠每日腹腔注射復(fù)方半邊蓮注射液1.668 ml/kg，連續(xù)給藥3周。

注射用還原型谷胱甘肽(陽性藥)[14]組：同模型組造模后，大鼠每日腹腔注射注射用還原性谷胱甘肽170 mg/kg，連續(xù)給藥3周。

2.2 建立大鼠阿霉素腎病模型

SD大鼠飼養(yǎng)適應(yīng)1周后，除空白組外的模型組、陽性藥組、復(fù)方半邊蓮注射液低、中、高劑量組，以一次性尾靜脈注射阿霉素的方法使大鼠形成腎病綜合征。具體操作如下：以注射用水20 ml將一瓶阿霉素(10 g)完全溶解，濃度稀釋至1 g/ml。按給藥劑量6.5 mg/kg緩慢推注阿霉素，靜注完后再靜推0.9% Nacl 1 ml，避免阿霉素滲透至皮下，導(dǎo)致爛尾現(xiàn)象發(fā)生，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。靜注結(jié)束后，各組大鼠均自由進(jìn)水進(jìn)食。

2.3 尿液及血液的采集

造模前一天及其后的每周均將各組大鼠置于清潔好的代謝籠中，收集24 h內(nèi)的尿液，禁食可自由飲水。尿液收集完成后，取部分尿液置于2 mL EP管中，-80℃冷凍保存。剩余尿液以蛋白尿定性試紙進(jìn)行定性檢測，造模前進(jìn)行比較，若由陰性或者中性結(jié)果變?yōu)殛栃裕瑒t視為造模成功。為能夠更加準(zhǔn)確的造模結(jié)果，亦以酶聯(lián)免疫法對24 h尿蛋白的含量進(jìn)行測定。

待6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，配制濃度為60 g/l的水合氯醛溶液，每只大鼠按6 ml/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射進(jìn)行麻醉，待麻醉成功后，于肝門靜脈取血5 ml，離心(3 500 r/min)10 min，取上清，凍存于-80℃冰箱待測。

2.4 數(shù)據(jù)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠活動(dòng)狀態(tài)

空白組大鼠飲食、飲水及活動(dòng)未見與平時(shí)有何明顯不同，精力較別組更為旺盛；模型組大鼠均出現(xiàn)睪丸水腫，前后爪水腫，精神狀態(tài)萎靡同時(shí)伴有不同程度的飲水量、尿量減少，體毛無光澤；各給藥組的這些情況均得到了不同程度的改善，其中以陽性藥物組和半邊蓮注射液高劑量組的情況改善最為明顯，整體狀況最為接近空白組大鼠。

3.2 大鼠體質(zhì)量、尿量及24 h尿蛋白的比較

結(jié)果如表1可知，模型組于造模開始第2周，與空白組相比體質(zhì)量顯著減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示其具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；半邊蓮注射液低劑量組與同期模型組相比體質(zhì)量體現(xiàn)出一定的增長趨勢，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而陽性藥組，半邊蓮注射液中、高劑量組在給藥后與同期模型組相比體質(zhì)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。

表1 造模及給藥前后各組大鼠體質(zhì)量比較

注：與空白組相比，*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比，#P<0.05,##P<0.01

結(jié)果如表2可知，模型組于造模開始第2周，與空白組相比尿量顯著減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示其具有顯著差異(P<0.05)；半邊蓮注射液低劑量組在給藥后與同期模型組相比體尿量體現(xiàn)出一定的增長趨勢，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而陽性藥組，半邊蓮注射液中、高劑量組在給藥后與同期模型組相比尿量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 造模及給藥前后各組大鼠24h尿量指標(biāo)比較

注：與空白組相比，*P<0.05;與模型組相比，#P<0.05

結(jié)果如表3與表4可知，模型組于造模開始第2周，與同期空白組相比24 h尿蛋白量開始顯著增多，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示其具有顯著差異(P<0.05或P<0.01)；且時(shí)間越長大鼠24 h尿蛋白量越多，至給藥第1周時(shí)出現(xiàn)大量蛋白尿；半邊蓮注射液低劑量組給藥后與同期模型組相比，尿蛋白含量有小幅變化，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而陽性藥組，半邊蓮注射液中、高劑量組在給藥后與同期模型組相比24 h尿蛋白量增長趨勢顯著減緩，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表3 造模及給藥前后各組大鼠尿蛋白定性結(jié)果

表4 造模及給藥前后各組大鼠24 h尿蛋白指標(biāo)比較

注：與空白組相比，*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比，#P<0.05,##P<0.01

3.3 大鼠腎功能、血脂及血清蛋白指標(biāo)的比較

結(jié)果如表5所示，與空白對照組比較，模型組ALB及TP含量(血清蛋白指標(biāo))顯著減少，變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，各組含量均有不同程度的增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表5 各組大鼠血清蛋白指標(biāo)比較

注：與空白組相比，*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比，#P<0.05,##P<0.01

結(jié)果如表6所示，與空白對照組比較，模型組BUN及Cr含量(腎功能指標(biāo))顯著減少，變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，各組含量均有不同程度的增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表6 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

注：與空白組相比，*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比，#P<0.05,##P<0.01

結(jié)果如表7所示，與空白對照組比較，模型組CHO及TG含量(血脂指標(biāo))顯著增加，變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，各組含量均有不同程度的減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表7 各組大鼠血脂指標(biāo)

注：與空白組相比，*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比，#P<0.05,##P<0.01

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以阿霉素經(jīng)尾靜脈注射后造成的腎病大鼠為研究模型，分別從尿液、血液及組織等方面考察復(fù)方半邊蓮注射液對模型大鼠的藥物作用效果如何，是否能夠緩解并改善腎病模型大鼠的病理狀態(tài)。

尿蛋白作為判定腎臟是否出現(xiàn)病理學(xué)變化的主要檢測指標(biāo)之一，在對尿液中尿蛋白進(jìn)行定量及定性的雙重測定后，初步確定該模型已造模成功后，繼續(xù)對后續(xù)給藥后的尿蛋白的含量進(jìn)行監(jiān)控發(fā)現(xiàn)，雖然低、中劑量組的藥效并不十分明顯，但高劑量及陽性藥組可以明顯降低尿液中尿蛋白的含量，表明其能夠?qū)δI臟起到一定的保護(hù)作用，對病變的腎臟起到治療作用。同時(shí)，對血液中的血肌酐、尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、總蛋白、血清白蛋白進(jìn)行了考察，與模型組相比較，各指標(biāo)均有明顯改善，血清白蛋白及總蛋白含量均明顯增多，其余指標(biāo)明顯減少，表明該藥物能夠起到改善腎功能、平衡血脂及提高血清內(nèi)蛋白含量的作用，即對腎病模型有明確的藥理作用，但是組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，低劑量給藥時(shí)，效果不明顯。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果揭示,復(fù)方半邊蓮注射液在腎病模型大鼠治療方面的效果，雖然當(dāng)其給藥劑量在低及中劑量時(shí)效果并不十分明顯，但是當(dāng)達(dá)到高劑量時(shí)其作用效果與陽性藥物相當(dāng)，為后續(xù)其在臨床研究中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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