王蔚，周忠光*，劉旭，王曉璐，費(fèi)洪新，李寶龍，韓玉生，仲麗麗，王金濤，李冰，喬羽

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江儒泰有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150000；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

腫瘤的危害眾所周知，其中消化系統(tǒng)惡性腫瘤在全部惡性腫瘤的發(fā)病及死亡中都占據(jù)前列，胃癌是中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第二位，死亡率第三位[1]，而肝癌、胰腺癌均預(yù)后極差。消化系統(tǒng)腫瘤的治療一直是醫(yī)學(xué)工作的重點(diǎn)，而中草藥的扶正祛邪功效可在腫瘤治療中發(fā)揮重大作用。樺褐孔菌(Inonotus obliquus)是一種具有多種藥用價(jià)值的中草藥，由文獻(xiàn)可知，上世紀(jì)六七十年代IO醇提取物被用來(lái)治療惡性腫瘤，表現(xiàn)出效果佳，毒性小[2]等特點(diǎn)。近年的國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究資料顯示，樺褐孔菌在抗腫瘤方面有良好效果[3-5]，但抗消化系統(tǒng)腫瘤方面的研究不夠完善。本文通過(guò)研究樺褐孔菌醇提物對(duì)幾種消化系統(tǒng)惡性腫瘤增殖和凋亡的影響，探討其抗消化系統(tǒng)腫瘤的作用機(jī)制，為胃癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤的治療提供新方法，新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌(黑龍江儒泰有限責(zé)任公司提供)；卡培他濱片(500 mg/片，上海羅氏制藥有限公司)；5-Fu(250 mg，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)；RPMI-1640、胎牛血清(武漢Boster公司)；MTT(美國(guó)Sigma公司)；胰蛋白酶、DMSO、熒光染劑PI和Hoechst33342(Beyotime公司)；鼠系MFC胃癌細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所)；人系胃癌細(xì)胞株BGC-823、胃癌細(xì)胞株MGC-803、胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3、肝癌細(xì)胞HepG-2(中科院上海細(xì)胞所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；低溫冰箱(海爾公司)；離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠LDZ5-2型)；倒置顯微鏡、正置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；電子天平(天津市天平儀器有限公司，MP-200A型)；METTLER XS205微量分析天平(深圳市怡華新電子有限公司)；UV-3600PLUS 分光光度計(jì)(日本島津)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Balc小鼠，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001，4～6周齡。自由攝食飲水，室溫(25±2)℃，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 樺褐孔菌醇提物的制備

稱取樺褐孔菌1 kg，加70%乙醇10 L，加蓋常溫下浸泡24 h，加熱回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾，取上清液，棄去沉渣，烘干上清液，得樺褐孔菌醇提物粉劑。此次樺褐孔菌提取物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。

1.4.2 體內(nèi)腫瘤抑制增長(zhǎng)試驗(yàn)

1.4.2.1 胃癌動(dòng)物模型的建立

將體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的MFC細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×106個(gè)/mL，在潔凈條件下，酒精清潔后，接種于小鼠腋下，接種量為0.2 mL細(xì)胞懸液，注射部位略有隆起。

1.4.2.2 分組及給藥

飼養(yǎng)24 h后，稱重，按樺褐孔菌醇提物高、中、低劑量，隨機(jī)分為6組，劑量確定依據(jù)查閱相關(guān)參考資料及預(yù)試所得[6-7],樺褐孔菌醇提物高、中、低劑量分別為4、2、1 mg/g，陽(yáng)性對(duì)照組藥物依據(jù)臨床應(yīng)用，選用抗消化道腫瘤常用口服藥物卡培他濱片，劑量經(jīng)人鼠等效劑量折算確定為0.5 mg/g，陰性對(duì)照組選用生理鹽水，空白組不做處理，每組10只小鼠。

1.4.2.3 觀察指標(biāo)

0.3 mL連續(xù)灌胃7 d和10 d。停藥次日處死動(dòng)物，取腫瘤，稱重，計(jì)算樺褐孔菌醇提物的抑瘤率。觀察肝臟等臟器的腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

1.4.3 體外腫瘤試驗(yàn)

1.4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用90%的RPMI-1640，10%的胎牛血清和1%的雙抗制作培養(yǎng)液，用于人系胃癌細(xì)胞株BGC-823、胃癌細(xì)胞株MGC-803、胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3的培養(yǎng)；用90%的DMEM，10%的胎牛血清和1%的雙抗制作培養(yǎng)液，用于人肝癌細(xì)胞HepG-2的培養(yǎng)。

1.4.3.2 MTT法測(cè)定藥物對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制情況

在各腫瘤細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，按樺褐孔菌醇提物給藥濃度分為6組，每組8個(gè)復(fù)孔。查閱相關(guān)資料及預(yù)試[8-9]，確定樺褐孔菌醇提取物各組劑量、陽(yáng)性對(duì)照組藥物5-Fu的濃度。樺褐孔菌醇提物高、中、低劑量分別為16、8和4 mg/mL,陽(yáng)性對(duì)照藥物5-Fu濃度為120 mg/mL。陰性對(duì)照組為生理鹽水，空白組為PBS溶液，用于計(jì)算和糾正誤差。接種后培養(yǎng)24 h，加藥20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入DMSO 150 μL，略微震蕩，在酶標(biāo)儀中測(cè)量吸光度，波長(zhǎng)定為570 nm。

1.4.3.3 免疫熒光法觀察IO醇提物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響

選取BGC-823對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種于6孔板，每孔2.5 mL，分組及給藥情況同上。實(shí)驗(yàn)依據(jù)帶電荷的PI不能使活細(xì)胞染色，Hoechst33342使活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的DNA染色，PI產(chǎn)生紅色熒光，Hoechst33342產(chǎn)生藍(lán)色熒光。可在活細(xì)胞中先加入Ho染料，再進(jìn)行PI染色，觀察凋亡情況。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心,去上清液，將其混懸于50 μL PBS溶液中。加入100 μL的PI，混勻，放于冰箱中染色30 min。再加入1.85 μL細(xì)胞固定液，混勻。加入50 μL Ho，混勻，放入冰箱中染色30 min。暗室中觀察，可見典型凋亡細(xì)胞表現(xiàn)，細(xì)胞體積小，呈圓形?；罴?xì)胞的Ho藍(lán)色熒光最強(qiáng)，早期凋亡細(xì)胞的Ho藍(lán)色應(yīng)該較弱，也可有微弱PI紅色熒光。晚期凋亡細(xì)胞PI紅色熒光加強(qiáng)，壞死細(xì)胞PI紅色熒光最強(qiáng)，而Ho藍(lán)色熒光較弱。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

用SPSS16.0軟件處理所得的數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移效果

2.1.1 各組抑瘤率比較

不同時(shí)間樺褐孔菌醇提物對(duì)MFC接種小鼠的抑瘤率，結(jié)果如表1和表2所示。

表1 7 d給藥的腫瘤抑瘤率比較

注：與空白組比較，*P<0.05

表2 10 d給藥的腫瘤抑瘤率比較

注：與空白組比較,*P<0.05

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。認(rèn)為樺褐孔菌醇提物對(duì)其有較好療效，且隨著濃度增加，療效增加。

2.1.2 腫瘤細(xì)胞大小及轉(zhuǎn)移灶情況

灌藥10 d后的小鼠，肉眼觀察腫瘤縮小較7 d給藥組顯著，肝臟等轉(zhuǎn)移灶處腫瘤消失，證明樺褐孔菌醇提物抗腫瘤具有一定的時(shí)間依賴性，且對(duì)轉(zhuǎn)移瘤也同樣有效。

2.2 體外干預(yù)結(jié)果

2.2.1 MTT法觀察體外抑制腫瘤增殖情況

由表3及圖1可見，樺褐孔菌醇提物對(duì)4種惡性腫瘤均表現(xiàn)為良好直接抗腫瘤效果，且有濃度依賴性。IO醇提物對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞的抑制率高劑量組明顯高于其他組，IO醇提物對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞中、低劑量組抑制率高于其他組，IO醇提物對(duì)肝癌HepG-2和胰腺癌Bxpc-3的抑制作用低于其他兩組。

表3 4種消化道腫瘤的體外MTT結(jié)果

圖1 MTT法腫瘤增殖抑制結(jié)果對(duì)比圖

2.2.2 免疫熒光法觀察BGC-823細(xì)胞凋亡情況

熒光圖像顯示，凋亡細(xì)胞隨濃度呈增加趨勢(shì)，圖2為BGC-823細(xì)胞各組的熒光染色圖片，與空白組對(duì)比，顯示明顯的促凋亡情況，且有一定的濃度依賴性。

高劑量組熒光圖像

中劑量組熒光圖像

低劑量組熒光圖像

5-FU組熒光圖像

空白組熒光圖像

陰對(duì)組熒光圖像

空白組和陰性對(duì)照組存活細(xì)胞最多，可見較多藍(lán)色熒光染色，陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組可見明顯紅色熒光，中劑量組和低劑量組的紅色熒光呈遞減趨勢(shì)。

3 討論

對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)和凋亡的抑制是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的根本原因之一[10]，因此有效的抗腫瘤藥物應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明確的抑制增殖，促進(jìn)凋亡作用[11]。在所有的惡性腫瘤中，消化道惡性腫瘤的治療一直是醫(yī)學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)，其治療的主要手段雖有所進(jìn)步，但還是以手術(shù)和放化療相互配合為主[12-14]，給患者的生存質(zhì)量帶來(lái)極大破壞。在這方面，中醫(yī)學(xué)提供了廣泛的思路，近幾年中醫(yī)輔助治療腫瘤非常具有成效[15]，樺褐孔菌作為一種具有廣泛民間使用基礎(chǔ)，毒性小，用途廣的中草藥，是值得關(guān)注的。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)、體外兩種途徑，對(duì)比樺褐孔菌醇提物對(duì)于消化系統(tǒng)幾種常見腫瘤的作用效果，推測(cè)其作用機(jī)制。證明樺褐孔菌醇提物對(duì)胃癌、肝癌、胰腺癌確實(shí)有效，但具有差異性。樺褐孔菌醇提物可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且具有濃度-時(shí)間依賴性，并且對(duì)轉(zhuǎn)移瘤有效。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，隨著給藥濃度的增加和給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)為明顯的抑瘤率增加；陰性對(duì)照組的抑瘤率為負(fù)數(shù)，從中醫(yī)學(xué)角度討論，可能為后天之本受損，引起機(jī)體免疫功能下調(diào)，導(dǎo)致腫瘤增長(zhǎng)加速，也可從側(cè)面推斷出樺褐孔菌醇提物的毒性小和免疫正性調(diào)節(jié)作用。體外實(shí)驗(yàn)可見對(duì)腫瘤增殖的直接抑制作用，其中胃癌的抑制作用最佳；通過(guò)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的初步研究，證明其對(duì)胃癌凋亡有促進(jìn)作用；通過(guò)與西藥組對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其抑制腫瘤增殖作用可能優(yōu)于西藥組，可見其促胃癌凋亡作用不弱于西藥組。

本實(shí)驗(yàn)研究同時(shí)對(duì)照多組消化系統(tǒng)腫瘤在樺褐孔菌醇提物作用下的情況，可確定藥物對(duì)消化系統(tǒng)惡性腫瘤的有效性及差異性，給臨床用藥的選擇提供了資料。其明確的抗腫瘤功效和低毒性、調(diào)節(jié)免疫特點(diǎn)為胃癌等腫瘤的治療打開了新思路，可解決西醫(yī)療法毒副作用大等缺點(diǎn)，同時(shí)為科學(xué)用藥提供依據(jù)。由此可見，樺褐孔菌是一種具有臨床應(yīng)用價(jià)值的可推廣藥物。

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