段曉杰，羅世林，王雄飛，楊雨薇，賡迪，趙仁云，鄭竹宏，丁玉婷，孫毅坤

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488)

地龍[1]始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名“蚯蚓”，主要成分有蛋白質(zhì)、酶類、氨基酸、脂類、核苷酸和微量元素等，具有抗凝血和纖溶、降壓、促進創(chuàng)傷修復(fù)、平喘及保護腎臟的作用。有學(xué)者曾研究地龍的再生過程中三種基因(Pex-lab01，Pex-lab02，Pex-lab03)的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有在地龍尾部斷體處理后，Pex-lab01和Pex-lab02的表達呈上調(diào)趨勢，這表明在早期的地龍再生過程中參與了創(chuàng)傷愈合過程[2]。

課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn),尾部斷體三天的地龍?zhí)崛∫耗苡行Т龠M創(chuàng)傷愈合，本實驗通過鹽析(飽和硫酸銨法)對提取液進行進一步分離，通過CCK-8法測定其對成纖維細胞增殖作用的影響，從而篩選活性較強的組分。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

勻漿機(IKAT10 basic)；pHS-3C型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)；冷凍離心機(TGL-20M,上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；潔凈工作臺(HD-1360，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)；倒置顯微鏡(OPTEC BDS200，重慶市奧特光學(xué)儀器有限責任公司)；離心機(Anke TDL-50B，上海安亭科學(xué)儀器廠)；酶標儀(ELX800，湘智離心機廠)。

1.2 實驗藥材與試劑

Tris(C4H11NO3，AMRESCO)；鹽酸(分析純，北京化工廠)；氯化鈉(NaCl，分析純，北京化工廠)；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)公司)；DMEM培養(yǎng)基(Cellgro公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；雙抗(北京拜耳迪生物科技有限公司)；0.25%Trypsin-EDTA(GIBCO公司)；硫酸銨((NH4)2SO4，北京化工廠)；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶(corning公司)；無菌0.22 μm過濾膜；赤子愛勝蚓(天津市東麗區(qū)成功蚯蚓養(yǎng)殖場)；NIH3T3(北京協(xié)和細胞資源中心)。

2 實驗方法

2.1 鹽析樣品的制備

在冰浴條件下向地龍粗提液[4]中緩緩加入飽和硫酸銨溶液(實驗前用氨水調(diào)pH值至7.2)，邊加邊攪拌，在4℃靜置1 h后低溫離心15 min，沉淀用Tris-HCl(0.01 M，pH 值7.2)緩沖液溶解，上清液繼續(xù)鹽析。低溫透析后依次得到飽和度分別為0～30%(S1)、30%～45%(S2)、45%～60%(S3)、60%～75%(S4)的樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 鹽析樣品活性篩選

NIH3T3采用“速融法”復(fù)蘇后培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)液中(含10%FBS和1%雙抗)。采用Trypan Blue對細胞進行計數(shù)后，調(diào)整細胞密度，接種于96孔板上，每孔100 μL(約5 000個細胞)，將培養(yǎng)板放到二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃飽和濕度)中培養(yǎng)。接種細胞分為給藥組(S1組、S2組、S3組、S4組)，陰性對照組和陽性對照組，陰性對照組只加完全培養(yǎng)液，陽性組加含有bFGF的培養(yǎng)液，另設(shè)調(diào)零孔，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后給藥，給藥后將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。再過48 h取出培養(yǎng)板，棄去舊的培養(yǎng)液，加入含有CCK-8的培養(yǎng)液(培養(yǎng)液：CCK-8=10∶1)110 μL，加完放入培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后，采用酶標儀測定吸光度，計算增殖率。增殖率以陰性對照組為100%計。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

不同組分在不同濃度下對成纖維細胞的增殖作用見表1。實驗結(jié)果表明，各實驗組細胞增殖率較陰性對照組均有統(tǒng)計學(xué)意義。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著蛋白濃度的增加對細胞的增殖作用也越來越強。S1、S3和S4組在蛋白濃度為6 μg/mL時增殖率達到最大值，分別為113.62%、117.03%和111.26%；而S2組在蛋白濃度為8 μg/mL時達到最大值，為108.58%。

表1 不同鹽析組分對NIH3T3增殖率的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

根據(jù)表1繪制各組細胞增殖率曲線，見圖1。由圖1可看出，在一定的蛋白濃度范圍內(nèi)，細胞增殖率隨著蛋白濃度增加呈依賴上升趨勢，當達到某一濃度后，細胞增殖率開始降低，甚至出現(xiàn)高濃度抑制生長現(xiàn)象。四組相較，S3促進NIH3T3增殖作用更趨于穩(wěn)定，且增殖率也相對較大。

圖1 不同鹽析組分促進NIH3T3細胞的增殖率曲線

4 討論

創(chuàng)傷修復(fù)過程中，多種生長因子、細胞及細胞外基質(zhì)相互作用，形成一個復(fù)雜的修復(fù)機制[5]。創(chuàng)傷愈合大致分為四個階段：止血和炎癥反應(yīng)階段、細胞增殖與新生血管階段、成纖維細胞與肉芽組織形成階段和組織重塑階段[6]。成纖維細胞增殖是在創(chuàng)傷修復(fù)的第二天開始的，是創(chuàng)傷修復(fù)的主要過程之一[7]，因此本實驗以藥物對成纖維細胞增殖作用的影響作為判斷評價創(chuàng)傷愈合情況的依據(jù)。

本實驗將斷體地龍?zhí)崛∫和ㄟ^鹽析分離得到S1、S2、S3和S4，通過測定給藥后成纖維細胞的增殖率，發(fā)現(xiàn)四種成分均對成纖維細胞有促進增殖的作用。但四組相較，S3組細胞增殖作用最強，且活性蛋白濃度范圍更廣泛。但本實驗僅以促進成纖維細胞的增殖作用作為篩選指標，不能充分說明其對創(chuàng)傷愈合的作用，因此實驗后期將以小鼠為研究載體建立在體創(chuàng)傷模型，對各組分進行進一步篩選驗證，從而闡明斷體地龍?zhí)崛∫捍龠M創(chuàng)傷愈合的物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1] 唐鼎,凃乾,李娟,等.藥用地龍的藥理作用和臨床研究進展[J].中國藥師,2015,18(6):1016-1019.

[2] Sungjin C,Kiseok K,Eun L,et al.Differential expression of three labial genes during earthworm head regeneration[J].Bioscience Biotechnology &Biochemistry,2009,73(12):2609-2614.

[3] 汪文琪,胡海聰,張志千,等.斷體地龍?zhí)崛∫捍龠M小鼠創(chuàng)傷愈合作用研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2015,17(7):1449-1453.

[4] 胡海聰,李翠芬,張碩峰,等.斷體地龍再生期提取液對成纖維細胞增生作用的研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(5):1126-1128.

[5] 闞成國,許樹軍,楊若婭,等.珍珠散對急慢性創(chuàng)面組織修復(fù)及堿性成纖維生長因子影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(1):37-39.

[6] 劉懷金,方彩華.運動創(chuàng)傷皮膚傷口愈合機制研究[J].體育科技文獻通報,2012,20(5):19.

[7] 秦全紅.成纖維細胞在皮膚創(chuàng)傷愈合中的作用及其調(diào)控[J].國外醫(yī)學(xué)(創(chuàng)傷與外科基本問題分冊),2000,27(1):33-36.