陳平平，張亞男，高鑫，王紅玉，劉樹民*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃芩古存今失的“逐水”功效研究是2014年“國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃-基于利水功效的中藥藥性理論研究”的重要組成部分。2015版《中國藥典》對黃芩性能及功效的論述為：“苦，寒。歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)。清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎”。但是從《本經(jīng)》至清代以前的本草著作中，記載黃芩具有明確的“逐水”功效，例如《神農(nóng)本草經(jīng)》載：“黃芩主諸熱黃疸，腸澼泄利，逐水，下血閉，惡創(chuàng)，恒蝕火瘍”；《證類本草》載：“黃芩主諸熱黃疸，腸澼泄痢，逐水下血閉，惡瘡疽蝕火瘍，療痰熱，胃中熱，小腹絞痛，消谷，利小腸，女子血閉，淋露下血，小兒腹痛”。而近現(xiàn)代醫(yī)著中則無此記載。黃芩“逐水”功效是被淘汰還是被遺漏，對這一功效是應(yīng)該繼承還是應(yīng)該廢除，成為本課題需要解決的科學問題之一。本實驗擬通過建立大鼠水負荷模型，在觀察黃芩引起大鼠尿量變化的同時，從對各臟器的水通道蛋白影響的角度剖析黃芩的利水作用，借此闡明黃芩古存今失的“逐水”作用的客觀性，不僅能夠在擴大黃芩臨床使用范疇及指導(dǎo)臨床用藥等方面起到積極的作用，也可以更加全面的補充利水功效的藥性理論研究的科學內(nèi)涵。

1 實驗材料

1.1 儀器與試劑

DG5033A酶標儀(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；TGL-20M高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；Elisa試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20161025)。

1.2 藥材

黃芩飲片(河北承德藥材有限公司，批號 20150623)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，符合《中國藥典》2015年版規(guī)定。取該批次黃芩600 g，第一次加10倍水煎煮1 h，第二次加8倍量水煎煮1 h，合并煎液，濃縮干燥，研成細粉備用。根據(jù)人的臨床用量，大鼠的等效劑量為人體每日用藥量的6.25倍，計算得出大鼠的給藥量，黃芩低劑量組為3 g生藥/kg，黃芩中劑量組為6 g生藥/kg，黃芩高劑量組為12 g生藥/kg。

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：[SCXK(黑)2015-004]，室溫(22±1)℃，相對濕度(65±5)%，實驗動物自由攝食飲水。

2 實驗方法

2.1 實驗動物篩選及分組

將SD雄性大鼠預(yù)先置于代謝籠中1～2天，觀察其自由飲水條件下尿量是否穩(wěn)定。實驗前禁食不禁水18 h，實驗開始時輕壓大鼠腹部，排盡膀胱內(nèi)余尿，按25 ml/kg灌胃給予去離子水，形成水負荷，收集2 h內(nèi)尿液，凡尿量超過40%水負荷者即為合格動物。

實驗動物分組及處置，取合格大鼠40只，隨機分為空白組、水負荷模型組、黃芩高、中、低劑量組，共5組，每組8只。將動物置于代謝籠中，各組大鼠均在每日上午9～10點按照10 ml/kg灌胃給予相應(yīng)的試劑，連續(xù)3日，每天1次。記錄每日飲水量、日間8 h尿量、夜間12 h尿量。第4日給藥同前，實驗前動物禁食不禁水12 h，實驗過程中禁食禁水，給藥1 h，各組大鼠腹腔注射生理鹽水5 ml，同時灌胃給予生理鹽水5 ml，實驗動物給藥完畢后，輕壓動物腹部排盡膀胱內(nèi)余尿，迅速放入代謝籠中，收集2 h尿量并記錄，連續(xù)6 h。水負荷試驗結(jié)束時，取各組大鼠的氣管、肝臟、腎臟、大腸、小腸、胰腺、心臟、肺臟、唾腺，-80℃冰箱凍存。

2.2 相關(guān)指標的檢測

取出之前凍存的臟器組織解凍后，剪碎，稱取0.2 g，按照1:9的重量體積比，放入1.8 ml的生理鹽水，加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨，最后將勻漿液以4 000 r/min，離心10 min，依據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書檢測心臟AQP1、大腸AQP2、肺AQP3、肺AQP4、小腸AQP4、肝AQP9、腎AQP2、氣管AQP3、氣管AQP4、唾腺AQP5、胰腺AQP3。

3 實驗結(jié)果

3.1 黃芩對正常大鼠尿量及飲水量的影響

表1和圖1～3結(jié)果所示，與空白組比較，各給藥組干預(yù)后均出現(xiàn)不同程度的干預(yù)效果，其中黃芩中劑量組大鼠第3天日間8 h尿量和夜間12 h尿量顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而且藥物干預(yù)組的大鼠出現(xiàn)少動、脫毛的現(xiàn)象，部分大鼠還出現(xiàn)便溏甚至水樣便現(xiàn)象。

表1 藥物對正常大鼠連續(xù)3天日間8 h、夜間12 h尿量及飲水量的影響

注：與空白組同期比較，★P<0.05，★★P<0.01

圖1 黃芩對正常大鼠日間8h尿量的影響

圖2 黃芩對正常大鼠夜間12 h尿量的影響

圖3 黃芩對正常大鼠飲水量的影響

3.2 黃芩對水負荷模型大鼠不同時間段尿量的影響

如表2和圖4～5結(jié)果所示，與空白組比較，模型組大鼠0～2 h、4～6 h及總尿量顯著性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，黃芩高劑量組大鼠4～6 h尿量明顯增加且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，黃芩中劑量組大鼠0～2 h、4～6 h及總尿量顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，顯示黃芩高、中劑量具有一定的利尿作用，當水負荷狀態(tài)時，其利尿作用效果較明顯而且持久。

表2 黃芩對水負荷模型大鼠不同時間段尿量的影響

注：與空白組同期比較，★P<0.05；與模型組同期比較，▲P<0.05

圖4 黃芩對水負荷模型大鼠不同時間段尿量的影響

圖5 黃芩對水負荷模型大鼠總尿量的影響

3.3 黃芩對水負荷大鼠水通道蛋白的影響

如表3和圖6所示，模型組與空白組比較，大腸AQP2、肺AQP3、肺AQP4、小腸AQP4、腎AQP2、氣管AQP3、氣管AQP4、唾腺AQP5、胰腺AQP3蛋白表達含量顯著性升高，且均具有顯著性差異(P<0.05)，心臟AQP1蛋白表達降低(P<0.05)；給藥干預(yù)后與模型組比較，黃芩高劑量組大鼠氣管AQP3、氣管AQP4、唾腺AQP5、胰腺AQP3蛋白表達均呈下調(diào)趨勢，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，黃芩中劑量組大鼠肺AQP3、氣管AQP3蛋白含量明顯降低且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，黃芩低劑量組大鼠肺AQP3、胰腺AQP3蛋白表達顯著性降低(P<0.05)。由此可看出黃芩高劑量組有明顯的通過對氣管、唾腺、胰腺的水通道蛋白下調(diào)，中、低劑量組對肺的水通道蛋白下調(diào)，調(diào)控水負荷大鼠各臟器分泌相關(guān)體液，進而發(fā)揮利水作用。

表3 黃芩對水負荷大鼠水通道蛋白的影響

注：與空白組比較，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

圖6 黃芩對水負荷大鼠水通道蛋白的影響

4 討論

在對古今文獻的整理與研究中我們發(fā)現(xiàn)，黃芩的“逐水”功效可能是客觀存在的[1]。盡管“逐水”作用不能簡單等同于利尿作用，但藥物的利尿作用卻是最能直接反應(yīng)其“逐水”的功效與特點。水液的代謝過程是生成、輸布及排泄的復(fù)雜生理過程，需要多個臟腑協(xié)調(diào)配合才能完成?！端貑枴そ?jīng)脈別論篇》中對水的代謝進行了精要的概述：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行”。水液的代謝涉及到了多臟腑如肺、脾、胃、腎、肝、小腸、大腸、膀胱、三焦等的功能[2]，各臟腑的功能正常，三焦水道通利，氣機運行暢通，則水液生成、輸布、排泄正常，能夠維持正常的生理功能。

現(xiàn)代研究中人們對于水在機體中的代謝過程了解一直不是很多,水的轉(zhuǎn)運機制一直被解釋為簡單擴散,直到20 世紀 90 年代初有研究者發(fā)現(xiàn)了水通道蛋白[3-4]。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一類在機體水液轉(zhuǎn)運和代謝中起重要作用的蛋白質(zhì)分子家族，AquaPorins(AQPs)家族的發(fā)現(xiàn)為研究不同組織水分子的跨膜轉(zhuǎn)運提供了分子生物學基礎(chǔ)，是對水調(diào)節(jié)機制研究的新里程碑，多種AQP與某些臨床疾病有著密切的關(guān)系，通過科學驗證，迄今在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)至少存在 13 種水通道蛋(AQP0-12)分子[5-6]。腎臟作為機體的泌尿器官，主要分布AQP1和AQP2，參與原尿形成中濾過、重吸收等重要生理過程[7]。肺臟水通道蛋白目前已證實分布于肺組織內(nèi)的AQP有4種(AQP1、AQP2、AQP3、AQP5)，主要位于肺毛細血管內(nèi)皮細胞、肺泡型上皮細胞和氣道上皮細胞膜上，參與這些細胞的水轉(zhuǎn)運。肝臟中水通道蛋白AQP9主要是作用肝硬化，研究表明肝硬化是以星形膠質(zhì)細胞分泌的I型膠原蛋白的沉積為特征[8-9],AQP9是重要的水通道蛋白，介導(dǎo)細胞凋亡開始和發(fā)展過程中水的丟失。AQP與人體泌尿、消化、呼吸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能密切相關(guān)。

現(xiàn)代醫(yī)學認為,水在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和代謝要通過AQP，可見津液代謝與AQP 密切相關(guān)，而且AQP在肺、消化系統(tǒng)和腎都有廣泛表達?？梢姡ǖ赖鞍着c水代謝關(guān)系密切，與中醫(yī)理論的肺、脾、腎等臟器相關(guān)。近年來，有關(guān)AQP在脾胃濕熱、脾胃濕阻、濕阻中焦等證候方面的作用受到越來越多的重視[10]，并有望成為相關(guān)疾病臨床治療的新靶點。此外，深入研究 AQP 的作用，可以更好的解釋痰、飲、水、濕等病理變化的機制。因此，AQP 可以成為詮釋“利水中藥”發(fā)揮其功效機制的一個新的靶分子，通過“津液代謝”這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探討 AQP 的變化與中藥“利水”功效的內(nèi)在聯(lián)系，還可以對“利水”這一作用進行量化研究，因而具有重要的理論與臨床意義[11]。

本研究結(jié)果表明，通過對正常大鼠以及水負荷模型大鼠尿量研究發(fā)現(xiàn)，黃芩可以不同程度的改變正常大鼠以及水負荷大鼠尿量，顯著性增加大鼠不同時間段尿量，由此推測出黃芩具有很好的利尿作用，當水負荷狀態(tài)時，其利尿作用效果明顯而且持久。實驗數(shù)據(jù)顯示,水負荷模型組可顯著升高臟器中水通道蛋白水平，與模型組比較，黃芩高、中、低劑量組干預(yù)后，均表現(xiàn)出不同程度的干預(yù)效果，其中黃芩高劑量組可顯著性抑制氣管AQP3、氣管AQP4、唾腺AQP5、胰腺AQP3等蛋白表達，黃芩中、低劑量組明顯降低肺AQP3、氣管AQP3、胰腺AQP3蛋白含量，說明黃芩可以通調(diào)水道從而抑制了機體對水的重吸收作用，起到利水作用。由此可以看出,黃芩高、中、低劑量有明顯的通過對氣管、胰腺以及肺、唾腺水通道蛋白下調(diào)，調(diào)控水負荷大鼠各臟器分泌相關(guān)體液，進而發(fā)揮利水作用。在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，給予黃芩后，大鼠出現(xiàn)不同程度的便溏癥狀，高劑量組表現(xiàn)更為明顯。黃芩性寒味苦，根據(jù)中醫(yī)學理論，當大量給予苦寒藥物時，可能會中傷脾胃，導(dǎo)至脾胃運化水液的功能異常，引起溏瀉、倦怠等癥狀。在本實驗中，當大量給予苦寒的黃芩時，部分水液通過大便排出體外。

根據(jù)以上的實驗結(jié)果，推測黃芩可以在一定程度上增加生理狀態(tài)下大鼠的尿量，為黃芩“逐水”功效提供了佐證。而對于黃芩干預(yù)病理狀態(tài)下大鼠的水液代謝的實驗研究，是黃芩“逐水”功效的重要體現(xiàn)。本課題將對心源性水腫、肝腹水等不同病理模型下的黃芩利水作用進一步深入研究。

[1] 苑藝蕾,汪娜,韓貞愛,等.黃芩“逐水”功效的文獻學考證[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(6):41-43.

[2] 劉志杰.傷寒論師承課堂實錄[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2009:12.

[3] Preston GM,Carroll TP,Guggino WB,et al.Appearance ofwater channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28protein[J].Science,1992,256(5055):385-387.

[4] Benga G.Birth of water channel proteins—the aquaporins[J].Cell Biol Int,2003,27(9):701-709.

[5] 郭昊,李學軍.細胞膜上的水通道—2003年諾貝爾化學獎工作介紹[J].生理科學進展,2007,38(3):283-289.

[6] 王永軍，李坤正，肖宗宇.水通道蛋白4的研究進展[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2016,13(26):129-131.

[7] 鄒旭,吳煥林.鄧鐵濤教授治療充血性心力衰竭經(jīng)驗選粹[J].中醫(yī)藥學刊,2004,22(4):583.

[8] Friedman SL.Hepatic stellate cells:protean,multifunctional,andenigmatic cells of the liver[J].Physiol Rev,2008,88(1):125-172.

[9] Friedman SL.Hepatic fibrosis overview[J].Toxicology,2008,254(3):120-129.

[10] Li H,Lee S,Jap BK.Molecular design of aquaporin-1 waterchannel as revealed by electron crystallography[J].Nature Structural &Molecular Biology,1997,4(4):263.

[11] 王鵬程,趙珊,王秋紅,等.利水中藥功效發(fā)揮與水通道蛋白之間的關(guān)系[J].中國中藥雜志,2015,40(12):2272-2277.