方林川，遲軍利，王俊芳*

（1. 武漢市農業(yè)科學院/湖北省園林植物工程技術研究中心，湖北武漢 430070；2. 蓬萊市葡萄與葡萄酒局，山東蓬萊 265600；3. 山東省農業(yè)科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工重點實驗室，山東濟南 250100）

我國葡萄生產區(qū)域極廣，除廣東、海南和臺灣省外，其他各省、市、自治區(qū)均有經濟產量的報告，產量居前5位的分別為新疆、河北、陜西、山東、云南，占全國總產量的50%以上[1]。目前種植的葡萄多數是歐亞種品種（V. vinifera），僅有少數是由美洲葡萄（V. labrusca），河岸葡萄（V. riparia），圓葉葡萄（V. rotundifolia）和山葡萄（V. amurensis）等種類選育或是與歐亞種雜交而來的品種。

葡萄栽培品種眾多，但大多數品質優(yōu)良的葡萄釀酒及栽培品種對多種病原微生物包括真菌、細菌與病毒等病原菌的抗性很差。其中，真菌病害如白粉病、霜霉病、白腐病和黑痘病是危害葡萄生產的主要病害，它們不僅會引起的產量下降，并且嚴重降低葡萄酒的品質。目前，對這些病害的應對措施依賴于化學防治[2]，然而，化學防治在增加農業(yè)生產成本的同時，會加劇生態(tài)環(huán)境的污染，甚至還對人類健康產生極大負面影響。為了從長遠和根本上解決葡萄抗病性差的問題，需要選育抗病品種進行推廣栽培，這是葡萄生產和育種上的重要課題。因此，葡萄的品質和抗性機理需要被不斷挖掘和應用，白藜蘆醇（Resveratrol）是其中的一個作用因素，本文試就葡萄中白藜蘆醇的功能與生物合成調控的研究進展作一綜述。

1 白藜蘆醇的結構與分布特點

1.1 白藜蘆醇理化性質

白藜蘆醇又稱芪三酚，化學名稱為3,4',5-三羥基二苯乙烯，是天然芪類化合物的代表，分子式為C14H12O3，相對分子量為228.25 kD，是無色針狀晶體，難溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等極性溶劑。芪類化合物是具有二苯乙烯母核的一類化合物的總稱，羥基為主要取代基，取代位置主要在3、4'、5位。1940年日本人Tokaoka首次從毛葉黎蘆（Veratrm grandiflorum）根部分離得到白藜蘆醇[3]，1974年在葡萄屬植物中葉找到了白藜蘆醇，并首次定性為一種葡萄屬植物對真菌侵染、傷害、紫外線照射后的反應產物——植物抗毒素（phytoalexin），并將其命名為viniferins（即葡萄素）[4]。在自然界中，白藜蘆醇多以單體或其糖苷（piceid, 3,5,4'-三羥基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷）形式存在，最常見的有4種形式：順、反式-白藜蘆醇（cis/trans-resveratrol）和順、反式-白藜蘆醇苷（cis/transpiceid）。白藜蘆醇羥基也可以被甲基、甲氧基或糖苷取代，形成一系列衍生物。天然芪類化合物可以以單體的形式存在，也可以形成低聚體。白藜蘆醇多存在于植物的木質部，目前已經在二十余科的植物中發(fā)現，包括豆科、?？?、蓼科、松科、桃金娘科、山毛櫸科、葡萄科等[5]。

白藜蘆醇的順式異構體光敏性強、極不穩(wěn)定[6]，其反式異構體的生物活性強于順式異構體[7]，在紫外光照射下反式-白藜蘆醇能夠轉化為順式-白藜蘆醇。白藜蘆醇在光下極不穩(wěn)定，反式-白藜蘆醇在完全避光時，可在乙醇中穩(wěn)定存在數月，但反式-白藜蘆醇在高pH（≥10）下穩(wěn)定性較差；而順式-白藜蘆醇在避光條件下只有在中性pH下較穩(wěn)定。自然界中常以反式-白藜蘆醇、順式-白藜蘆醇苷及反式-白藜蘆醇苷存在于植物中。

1.2 白藜蘆醇在葡萄中的分布與含量

近年來，關于白藜蘆醇在葡萄中的分布已有了大量的研究，但在葡萄的不同組織器官及不同的品種中，白藜蘆醇的含量不同，且差異很大。Pool等[8]發(fā)現木質部中含量較低，成熟葉片中含量較幼葉高。果皮、果穗梗中含有較多的反式-白藜蘆醇，而葡萄芽和花中白藜蘆醇含量較低[9]，其他研究者也認為，葡萄果實中白藜蘆醇主要存在于果皮和種子中，果肉中很少或沒有[10]。陳雷和韓雅珊[11]發(fā)現，葡萄品種間各組織白藜蘆醇含量的差異較大，總體而言，反式-白藜蘆醇含量從高到低的順序是：果穗軸、果皮、葉片、種子、葉柄。Li等[12]連續(xù)兩年研究發(fā)現除少數品種含量較高外，大部分品種的果皮和種子中白藜蘆醇含量小于2 μg/g FW，而在果肉中基本沒有檢測到反式-白藜蘆醇。李婷等[13]測定14個品種葡萄不同器官組織的反式-白藜蘆醇含量，其含量由高到低的順序為果梗、葉片、果皮、種子、葉柄。研究表明，葡萄中的各個器官都含有白藜蘆醇，‘赤霞珠’的各個部位都有反式-白藜蘆醇，但是含量不同，高低順序依次為：莖段韌皮部、腋芽、根、莖段木質部、莖尖、葉柄、葉片，但是在芪合酶（STS）mRNA的轉錄和蛋白質翻譯在葉片中最高，對白藜蘆醇合成的關鍵酶STS進行免疫組織化學分析表明：STS mRNA在不同的器官中具有組織特異性，與蛋白質的含量分布是一致的[14]。

白藜蘆醇的含量在不同品種中變異很大，Li等首次從種質資源水平上評價葡萄白藜蘆醇含量，發(fā)現種間雜交的砧木品種果皮和種子含有比其它栽培品種高得多的白藜蘆醇[12]。種質資源中白藜蘆醇含量的調查研究表明，在大多數研究的葡萄種質中，高抗性的砧木品種如‘貝達’等含有365.98 μg/g的白藜蘆醇，而在釀酒和鮮食葡萄果皮中白藜蘆醇含量較低，以及美洲葡萄與歐亞種之間的種間雜種含量較親本更低。此外，它們的總分布在很大程度上偏向于低含量，其含量遠遠低于平均水平。然而，在栽培品種中也存在一些特例，例如‘維納斯無核’（Venus）（154.77 μg/g FW），‘皇后無核’（Queenors Seedless）（102.19 μg/g FW）等品種仍具有相對較高的白藜蘆醇含量[15]。

2 白藜蘆醇的功能及其體內外活性

2.1 白藜蘆醇與葡萄抗病性的關系

白藜蘆醇是在植物受到病原性進攻和環(huán)境惡化時產生的植物抗毒素，它的含量與植物抗菌能力呈正相關。有人認為，白藜蘆醇抗葡萄灰霉的活性與其電子特性、分子體積及親脂性大小有關，它可破壞細胞膜并干擾電子傳遞系統的蛋白質[16]。白藜蘆醇可以抑制植物病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)。例如，Alonso-Villaverde等[17]

的研究證明，葡萄植株一旦被病原菌感染，就會在感染部位迅速產生高濃度強毒性的δ-葡萄素（δ-viniferin）和紫檀芪（pterostilbene），并發(fā)現葡萄體內的芪類化合物能有效地防御3種主要真菌病原菌：灰霉菌（Botrytis cinerea）、霜霉菌（Plamopara viticola）和白粉菌（Erysiphe necator）。目前，白藜蘆醇對真菌的毒性機理尚未得到揭示，但通過表達STS基因獲得抗病植物的策略已被大量成功地用于了植物的遺傳轉化。在應用STS基因進行遺傳轉化的研究中，多數植物過量表達STS基因后對特定真菌病害的抗性增強。例如，Hain等[18]將從葡萄中分離出的兩個芪合酶基因Vst1和Vst2轉入煙草，使得煙草植株對灰霉菌具有了更高抗性，這也成為外源植保素基因在植物中表達提高其抗病性的首次報道。此研究發(fā)現，STS轉基因植物對稻瘟菌、白粉病菌、早疫病菌的抗性均有一定程度的增強，但同一種植物轉基因植株間的抗病能力存在一定的差異。其它外源轉化葡萄STS基因并取得成功的例子還包括：轉STS基因的小麥提高了對灰霉病、柄銹菌與殼針孢的抗性[19]，轉化大麥提高了對灰霉病的抗性[20]，轉化歐亞種葡萄提高了對灰霉病的抗性

[21]，轉化番木瓜提高對棕櫚疫霉菌的抗性[22]。Duan等[23]證實，不同葡萄品種對霜霉病的易感性高低與白藜蘆醇在植株中的誘導合成能力呈顯著負相關，進一步說明葡萄白藜蘆醇能直接提高植株的抗病性。

2.2 白藜蘆醇在健康領域的應用

1997年，Jang等研究發(fā)現，白藜蘆醇在癌變的三個主要階段（始發(fā)、促癌和演進）中均表現出化學防癌活性[5]。在小鼠乳腺培養(yǎng)細胞的癌變模型中，他們證實白藜蘆醇能抑制腫瘤的形成。這篇文獻的發(fā)表使白藜蘆醇的抗腫瘤活性成為研究的熱點，同時也使更多的研究者開始關注白藜蘆醇，也因此被譽為繼紫杉醇后又一新的綠色抗癌藥物[24]。

隨后，在動物實驗中，白藜蘆醇的各類功效被不斷證實。2000年前后的一系列研究表明，高劑量的白藜蘆醇在體內具有抗炎、清除自由基、抑菌和防癌的作用。在我國，早已使用含白藜蘆醇的中藥材虎杖已用于治療和預防高血脂、動脈硬化。同時，白藜蘆醇可以從多個方面對心血管發(fā)揮保護作用[25]。此外，《自然》上的一項研究表明，即使采用比以往的一些著名研究中低1000倍劑量的白藜蘆醇，都可以顯著地激活抗衰老的信號通路，從而導致腫瘤抑制基因p53和長壽基因FOXO3A與SIRT6的活化，這說明日常生活中從食物中獲得的白藜蘆醇是足夠產生功效的[26]。

3 白藜蘆醇的體內合成途徑

包括白藜蘆醇在內的芪類化合物，在植物體內是通過苯丙氨酸代謝途徑合成的。合成過程受到多種酶的調控，依次為苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、香豆酰-CoA連接酶（4CL）、芪合酶（STS）。其中芪合酶是芪類化合物合成的關鍵酶，它可以催化丙二酰-CoA和香豆酰-CoA合成白藜蘆醇，或催化丙二酰-CoA和肉桂酰-CoA生成赤松素。白藜蘆醇可以繼續(xù)經羥基化、糖基化等修飾，或通過聚合生成多種芪類物質。

目前對葡萄中芪類化合物開展的研究比較多。對已報道的葡萄科植物中的芪類化合物進行統計，發(fā)現共從葡萄科植物分離得到54種芪類化合物，其中來源于葡萄的有13種，約占總數的24%[27]。由于STS在芪類化合物生物合成途徑中起著重要的調節(jié)作用，被發(fā)現是芪合物合成的限速酶，因此近年來芪合酶基因的研究得到了人們的廣泛關注，并取得了一系列進展。

STS基因多以基因家族的形式存在，即它們是由同一祖先基因經過重復和變異所產生的一組基因。對從松樹、葡萄、虎杖等植物中分離出來的STS基因的研究結果顯示，對于相同植物STS基因家族的不同成員，它們的氨基酸序列具有非常高的相似性。王西平等[28]利用RTPCR從中國野毛葡萄克隆了2個cDNA全長均為1179 bp的芪合成酶基因VqSTS1和VqSTS2，它們編碼的392個氨基酸中僅有12個氨基酸不同，氨基酸序列中247～257位點的“IPNS/FAGAIAGN”是芪合成酶家族固有的氨基酸保守結構域。通過查找葡萄全基因組，發(fā)現在歐洲葡萄‘黑比諾’中，共有48條STS基因，其中至少32條基因是具有功能的[29]。

4 白藜蘆醇合成的表達調控

白藜蘆醇是葡萄中一種重要的植保素，一方面被認為參與了植物體內的非生物與生物脅迫的適應性，另一方面具有很好的藥理學活性，被證實在人體內有很好的防突變、抗癌與抗氧化的活性。由于STS本底表達水平很低，只在受多種逆境誘導表達才會大量合成表達，因此，它的表達受到嚴格的轉錄調控。從分子水平上研究STS的表達調控機制，是了解葡萄白藜蘆醇積累規(guī)律的重要內容。多項研究表明，白藜蘆醇在不同類型的葡萄種質中含量變異非常大，幾乎從0到400 μg/gFW[12]。而對這些白藜蘆醇含量差異極其顯著的種質中STS基因表達量及功能進行分析后發(fā)現，白藜蘆醇與STS表達量高度正相關，且STS是白藜蘆醇合成的限速酶[30]。此外，葡萄受到不同生物脅迫（如真菌感染）和非生物脅迫（UV-C、干旱、機械損傷）時，其合成的關鍵結構基因STS被誘導表達，且表達量上升達30～40倍，白藜蘆醇含量在葉片和果實中快速積累[31]。上述系列研究表明，葡萄果實中白藜蘆醇的含量差異極有可能是由轉錄調控途徑上的差異造成的，然而，STS基因具體受到哪些基因的表達調控，其上游的表達調控網絡是如何構成的，是一個十分復雜但有吸引力的科學問題。

針對這一問題，科研人員進行了廣泛而深入的探索。在用麥角甾醇誘導葡萄灰霉病抗性提高的過程中，Laquitaine等[32]發(fā)現了STS與WRKY基因及LTP基因協同表達，暗示WRKY基因可能作用于STS基因的上游，從而直接或間接參與了STS的表達調控。隨后，Wu等[33]從抗白粉病的華東葡萄及不抗白粉病的兩個歐亞種中分別克隆出了STS基因的3條啟動子，序列結構分析結果表明，STS核心啟動子區(qū)域存在可被WRKY轉錄因子結合的W-Box元件，其中，歐亞種中W-box數目較華東葡萄中多出1個。隨后，H?ll等[34]通過葡萄愈傷組織過量表達及葉片的瞬時轉化，首次報道了葡萄MYB14與MYB15轉錄因子參與了STS的表達調控，但研究未能深入揭示它們轉錄激活STS的機理。2015年，Fang等[35]研究發(fā)現，MYB14通過結合在STS基因啟動子的L5-BOX順式作用元件上起到直接的轉錄激活作用，且在葡萄的32條有功能的STS基因啟動子區(qū)，29條含有該L5-BOX元件。與此同時，對于高白藜蘆醇含量和低白藜蘆醇含量的葡萄品種而言，它們分別對應著不同的STS與MYB14的表達量，因此，STS與MYB14的表達量是決定葡萄白藜蘆醇含量的直接因素。此外，大量基因芯片共表達分析的結果表明，有更多的基因協同參與了對STS的表達調控。這一發(fā)現隨后被Vannozzi等[36]的研究工作證實，他們發(fā)現WRKY基因家族的3個成員可以與MYB家族成員協同調控STS基因的表達。除了已知的轉錄因子參與到STS的表達調控，Jiao等[37]還發(fā)現VqMAPKKK38基因可以正向調控芪合成酶基因的表達而提高葡萄芪類物質的積累，同時鈣離子信號和活性氧（ROS）信號位于VqMAPKKK38基因的上游，激活VqMAPKKK38的表達，進而正調控葡萄芪合成酶基因的激活和芪類物質的積累。在轉錄因子的上游，鈣信號系統被認為參與調控植物生長發(fā)育和病程相關基因的表達，其中，山葡萄中鈣依賴型蛋白激酶VaCPK20的過量表達使葡萄中VaSTS7基因轉錄水平提高并且白藜蘆醇的積累高出對照9～68倍[38]。對葡萄愈傷組織進行轉基因研究的結果表明，CPK29對白藜蘆醇的合成也有顯著的促進作用，暗示此基因可能在轉錄因子的上游發(fā)揮調控作用[39]。以歐亞種為試材的研究表明，MYB14啟動子受flg22的誘導過程中也依賴于鈣離子信號系統的激活[40]。上述結果說明，STS的表達調控網絡上存在多個上游信號，影響了包括R2R3-MYB及WRKY基因家族轉錄因子的表達，從而協同調控一系列STS基因的表達，進而幫助植物適應多種逆境脅迫環(huán)境。

5 展望

盡管目前已在多種植物中發(fā)現了芪類化合物，但大部分植物中白藜蘆醇含量較低，具有開發(fā)價值的植物并不多，而隨著白藜蘆醇的藥理活性和保健功能不斷發(fā)現，其在人類健康領域具有越來越好的應用開發(fā)前景，而葡萄因為其較高的含量與較好的安全性倍受關注。目前就白藜蘆醇的提取而言，不同的組織可以選用不同的浸提劑，總的來說，乙酸乙酯或甲醇效果較好，且HPLC仍是最廣泛與成熟的白藜蘆醇定量檢測的方法；然而，未來可能需要開發(fā)更加快捷的基于HPLC-MS等廣泛靶向代謝組學的方法去對不同白藜蘆醇的衍生物進行研究，一方面可以實現對多種次生代謝產物（如果實或葡萄酒中的類黃酮、有機酸、多酚類）的高通量檢測與聯合分析，另一方面新技術的應用可能會發(fā)現更多種類的白藜蘆醇衍生物或聚合物。

盡管懸浮培養(yǎng)是白藜蘆醇的工業(yè)化生產的一種選擇，然而，選擇何種葡萄品種及起始培養(yǎng)材料作為細胞供體能實現白藜蘆醇的最大化生產，則需要探討白藜蘆醇生物合成表達調控的關鍵因子。利用已經發(fā)現的白藜蘆醇生物合成調控基因，并以它們?yōu)榘悬c，運用遺傳轉化、CRISPR-Cas9介導的基因敲除等手段去精準調控關鍵結構基因的表達從而決定白藜蘆醇的合成，可能是實現未來白藜蘆醇產業(yè)化發(fā)展的一個重要方向。

近年來，盡管白藜蘆醇生物合成的表達調控已經取得了一些突破性的進展，包括鑒定到了以MYB14/MYB15為核心，與WRKY協同作用的多個正調控轉錄因子，然而，基因的轉錄調控涉及一套精細復雜的信號網絡，目前的研究僅揭示了STS啟動子調控的一部分上游信號，遠未能闡明葡萄白藜蘆醇響應逆境脅迫表達與不同種質中差異積累的分子機制；同時，對植株的抗病性及高白藜蘆醇含量葡萄育種而言，可能需要利用多樣化的種質資源，尤其在含量極高的野生種質如冬葡萄（V.berlandieri）與河岸葡萄（V. riparia）或高抗白粉病種質如華東葡萄(V. pseudoreticulata）中，明確在其中白藜蘆醇高效積累的規(guī)律，而后通過基因組學、轉錄組學、代謝組學等多學科交叉的手段進一步挖掘白藜蘆醇生物合成表達調控的信號組分是非常有必要的，此項工作一方面可以進一步明晰葡萄對外界不利環(huán)境適應性進化產生差異的原因，另一方面有利于生產上實現少施農藥并提高果實品質的葡萄健康生產。