胡重怡，張 威，郭 平，呂小麗，王 棟

(江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330001)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，直接推動(dòng)了生命科學(xué)領(lǐng)域的飛速發(fā)展。在20世紀(jì)90年代后期，美國(guó)ABI公司在第一代PCR的基礎(chǔ)上推出了第二代PCR技術(shù)——實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)，使得高靈敏、高特異性和精確定量的體外定性/半定量基因分析技術(shù)成為現(xiàn)實(shí)，但是，由于qPCR擴(kuò)增過(guò)程中不能保證在反應(yīng)過(guò)程中擴(kuò)增效率保持不變和實(shí)際樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以及不同樣品之間的擴(kuò)增效率是相同的，由此導(dǎo)致其定量分析所依賴的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值(Ct)不是恒定不變的，結(jié)果只是相對(duì)定量，且依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線。在20世紀(jì)末期，為了達(dá)到絕對(duì)定量的目的，美國(guó)科學(xué)家Vogelstein和Kinzler提出了第三代核酸檢測(cè)定量分析技術(shù)——數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)[1]，近年來(lái)數(shù)字PCR迅速發(fā)展起來(lái)并成為一種常用的核酸檢測(cè)定量分析技術(shù)。

與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值(Ct)進(jìn)行定量，不受擴(kuò)增效率的影響，也不需要采用內(nèi)參基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析，具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)，目前該方法在轉(zhuǎn)基因定量分析、物種鑒定、醫(yī)學(xué)診斷、致病微生物定性和定量分析等領(lǐng)域有較為寬闊的應(yīng)用前景。

目前，各國(guó)對(duì)食品安全均高度重視，加大了對(duì)食品的生產(chǎn)、加工、流通和銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)管理和監(jiān)控的力度。傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此亟需開(kāi)發(fā)出快速、方便、準(zhǔn)確、靈敏的食品檢測(cè)技術(shù)。數(shù)字PCR可以在2～3 h對(duì)食品樣品中核酸進(jìn)行精確定量，在食源性病原體鑒定和預(yù)警、食品原材料摻假等現(xiàn)場(chǎng)中均能夠快速出具檢測(cè)報(bào)告，現(xiàn)已開(kāi)始廣泛被應(yīng)用于食品快速檢測(cè)中。本文就數(shù)字PCR技術(shù)在食品快速檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了回顧。

1 數(shù)字PCR的原理

數(shù)字PCR的技術(shù)原理可以用“分而治之”一句話簡(jiǎn)短概括，具體做法是先將核酸模板進(jìn)行大量稀釋，使其分配到大量的獨(dú)立的反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元對(duì)應(yīng)不同數(shù)量的DNA模板分子。然后，對(duì)每個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)室的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。最終，根據(jù)泊松分布和熒光信號(hào)陽(yáng)性的反應(yīng)單元占總反應(yīng)單元的比例來(lái)計(jì)算目的核酸序列拷貝數(shù)，因此數(shù)字PCR可以不需要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就能實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì)定量分析[2]。

雖然數(shù)字PCR技術(shù)的原理并不復(fù)雜，早在1992年Sykes等[3]就描述過(guò)其原理，然而在樣品分配的環(huán)節(jié)上卻一直難以突破，分配的數(shù)量和均勻性上都很難達(dá)到要求，Vogelstein等[1]在早期發(fā)明數(shù)字PCR時(shí)用市售的384孔板進(jìn)行，需要進(jìn)行大量分裝和使用大量的試劑，人力成本和高昂的費(fèi)用使得研究人員望而卻步。直到近十幾年來(lái)，油包水乳化微滴、集成微流體通路、納米技術(shù)的快速發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)終于突破了技術(shù)瓶頸，2006年美國(guó)Fluidigm公司基于集成微流體通路的原理成功開(kāi)發(fā)出第一臺(tái)商業(yè)化的數(shù)字PCR系統(tǒng)，從此數(shù)字PCR走進(jìn)了商業(yè)化應(yīng)用階段。

目前，商業(yè)化的數(shù)字PCR產(chǎn)品按照分配樣品的方式可以分成兩大類：微滴式數(shù)字PCR(dropplet dPCR，ddPCR)和芯片式數(shù)字PCR(chip dPCR，cdPCR)，微滴式數(shù)字PCR以Bio-Rad公司和Raindance Technologies公司系統(tǒng)為代表，其主要原理是把每個(gè)樣本的反應(yīng)液均勻分割成數(shù)萬(wàn)個(gè)乳液包裹的微液滴，在每個(gè)微滴內(nèi)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后通過(guò)類似于流式細(xì)胞技術(shù)的方法逐個(gè)對(duì)液滴的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算含目標(biāo)熒光的液滴占所有液滴的比例來(lái)檢測(cè)目的序列的含量。而芯片式數(shù)字PCR以Fluidigm和Life Technology公司系統(tǒng)為代表，在這一技術(shù)中，反應(yīng)液通過(guò)微流控等技術(shù)被均勻?qū)胄酒系姆磻?yīng)倉(cāng)或通孔中進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后通過(guò)類似于基因芯片的方法掃描每個(gè)反應(yīng)倉(cāng)或者通孔的熒光信號(hào)，進(jìn)而計(jì)算目的序列的含量[4]。目前這2種方法均能達(dá)到對(duì)單個(gè)樣品分配成2萬(wàn)個(gè)以上獨(dú)立的PCR反應(yīng)，均能滿足對(duì)樣品的精確定量。

2 食源性病原體的快速檢測(cè)

食源性疾病對(duì)人體健康易造成重大危機(jī)，而常規(guī)的微生物檢測(cè)需要對(duì)待檢樣品進(jìn)行增菌、分離、生物學(xué)鑒定等多個(gè)步驟，具有耗時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)操作繁復(fù)、特異性差和檢出限高等問(wèn)題，并且對(duì)一些無(wú)法培養(yǎng)的致病病原體，傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法往往無(wú)能為力；數(shù)字PCR技術(shù)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，彌補(bǔ)了常規(guī)檢測(cè)方法的缺陷[5]。在食品中毒突發(fā)事件中，快速檢測(cè)并確定何種食源性病原體也是后續(xù)治療的關(guān)鍵參考因素，數(shù)字PCR技術(shù)在對(duì)食源性病原體的鑒定中起到重要作用。

在全球食物中毒事件中，常見(jiàn)的食源性致病體主要分為細(xì)菌性腸道致病菌和食源性病毒。常見(jiàn)的細(xì)菌性腸道致病菌有致病性大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、布魯氏菌、空腸彎曲菌、蠟樣芽孢桿菌、霍亂弧菌等。通過(guò)食品傳播的食源性病毒主要有諾如病毒、輪狀病毒、甲肝病毒和戊肝病毒等，值得引起注意的是目前病毒性腹瀉發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，僅次于細(xì)菌性腹瀉，尤其是諾如病毒，經(jīng)常造成群體病毒性胃腸炎公共事件。

目前，針對(duì)常見(jiàn)的食源性病原體，如沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌O157∶H7、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、阪崎腸桿菌、諾如病毒等均已開(kāi)發(fā)數(shù)字PCR的方法[6-10]，對(duì)熒光定量PCR和數(shù)字PCR方法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR具有更高的靈敏度和更少的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)抑制劑的抗性強(qiáng)，結(jié)果快速、敏感、可靠，且能做到絕對(duì)定量[11]。在多重致病菌檢測(cè)中，利用數(shù)字PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法對(duì)水樣中沙門氏菌、空腸彎曲桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了檢測(cè)和比較，結(jié)果顯示：平板培養(yǎng)法僅對(duì)沙門氏菌檢出，實(shí)時(shí)熒光定量PCR也存在漏檢的情況，數(shù)字PCR對(duì)3種細(xì)菌都能實(shí)現(xiàn)檢出[6]。數(shù)字PCR的抗抑制能力使其可能成為高通量篩選微生物以評(píng)估食品質(zhì)量和安全性的有用策略，目前也已開(kāi)發(fā)了同時(shí)檢測(cè)乳制品中8種致病病原體的數(shù)字PCR方法[12]。

3 轉(zhuǎn)基因食品的快速檢測(cè)

自從1996年轉(zhuǎn)基因作物被批準(zhǔn)商業(yè)應(yīng)用以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物的商品化種植得到迅速發(fā)展。目前隨著全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類與數(shù)量逐漸增加，為滿足轉(zhuǎn)基因作物及其加工食品的安全監(jiān)管需求，亟需開(kāi)發(fā)快速和準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)。以往熒光定量PCR法在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中必須依據(jù)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待檢樣品進(jìn)行相對(duì)定量，無(wú)法對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行絕對(duì)定量，還容易對(duì)低含量轉(zhuǎn)基因成分出現(xiàn)漏檢，此外易受樣品中抑制劑的影響，造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。而數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)低豐度核酸樣本檢測(cè)重復(fù)性好，對(duì)抑制成分不敏感，該方法在高通量轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中檢測(cè)成本也相對(duì)更低，可作為轉(zhuǎn)基因成分快速檢測(cè)技術(shù)[13]。

目前，數(shù)字PCR被大量應(yīng)用在商業(yè)化最普遍的轉(zhuǎn)基因大豆和玉米中。K?ppel等[14]對(duì)4個(gè)新的大豆性狀位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因株系開(kāi)發(fā)了多重檢測(cè)數(shù)字PCR方法。Fu等[15]針對(duì)9個(gè)大豆轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了免預(yù)處理的數(shù)字PCR方法，檢測(cè)限為0.1%，低于歐盟的標(biāo)記閾值水平。Demeke等[16]對(duì)2種轉(zhuǎn)基因大豆加標(biāo)樣品進(jìn)行數(shù)字PCR定量分析，數(shù)字PCR可以對(duì)0.001%加標(biāo)DNA樣品進(jìn)行精確定量分析。Corbisier等[17]用數(shù)字PCR和熒光定量PCR對(duì)2種轉(zhuǎn)基因玉米的絕對(duì)拷貝數(shù)的比例進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR具有更高的精確度，可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的DNA拷貝數(shù)比率。Morisset等[18]利用數(shù)字PCR同時(shí)檢測(cè)2種轉(zhuǎn)基因玉米基因拷貝的絕對(duì)數(shù)量，雙重?cái)?shù)字PCR測(cè)定的靈敏度與單獨(dú)數(shù)字PCR靈敏度相當(dāng)。Dobnik等[19]對(duì)所有12個(gè)歐盟授權(quán)的轉(zhuǎn)基因玉米品系開(kāi)發(fā)了2個(gè)獨(dú)立的多重?cái)?shù)字PCR方法，可以一次檢測(cè)12個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米基因拷貝數(shù)。目前，開(kāi)發(fā)多重?cái)?shù)字PCR方法進(jìn)行快速檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的熱點(diǎn)問(wèn)題。

4 食品源成分的快速檢測(cè)

由于市場(chǎng)需求激增和原料價(jià)格的上漲，部分企業(yè)為了減少生產(chǎn)成本，在食品生產(chǎn)和銷售過(guò)程中，摻入成本低廉的非產(chǎn)品標(biāo)志的原料，以次充好、摻雜等問(wèn)題日益突出，在食品安全監(jiān)管過(guò)程中，需要開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確的食品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)方法。數(shù)字PCR由于不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，可直接測(cè)得樣品中目標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)，目前該技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力越來(lái)越受到關(guān)注。在動(dòng)物源食品的摻假中，主要存在將廉價(jià)肉(如鴨肉)冒充或摻假高價(jià)肉的問(wèn)題，目前對(duì)雞肉、牛肉、豬肉、羊肉等動(dòng)物源食品中摻假鴨肉均已開(kāi)發(fā)出數(shù)字PCR方法[20-21]。在植物源食品摻假中，目前數(shù)字PCR同樣也能應(yīng)用在高價(jià)植物源食品摻假低價(jià)原料的鑒定，如橄欖油純度、香味水稻的檢測(cè)[22-23]。此外，數(shù)字PCR技術(shù)在植物源食品分析中還能對(duì)植物油通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物源成分來(lái)鑒定地溝油[24]。數(shù)字PCR可以靈敏地檢測(cè)出食品源摻假種類，并可以根據(jù)原料重量、DNA量和基因拷貝數(shù)的線性關(guān)系確定摻假比例，這是其他檢測(cè)方法所不具備的優(yōu)勢(shì)[22]。

5 結(jié)論與展望

數(shù)字PCR雖然是近10年剛發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，但其憑借較好的準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性、絕對(duì)定量等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)在食品快速檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用。目前，數(shù)字PCR技術(shù)在食源性致病微生物、轉(zhuǎn)基因成分和食物源性成分的快速定量檢測(cè)中都得到了較廣泛的應(yīng)用，尤其因數(shù)字PCR抗抑制能力強(qiáng)，可以開(kāi)發(fā)多重?cái)?shù)字PCR，通過(guò)一次檢測(cè)在2～3 h可以對(duì)不同靶標(biāo)基因進(jìn)行高通量篩查。但目前數(shù)字PCR儀器較昂貴，多重?cái)?shù)字PCR要求開(kāi)發(fā)出配套試劑，試劑價(jià)格也較高昂，相信隨著數(shù)字PCR技術(shù)和生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，該技術(shù)將普遍應(yīng)用于食品快速檢測(cè)篩查中。相信在不久的未來(lái)，數(shù)字PCR技術(shù)將大大提高食品快速檢測(cè)效率，并為食品安全的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供一種簡(jiǎn)易、快捷的檢測(cè)手段，進(jìn)而保障消費(fèi)者的健康。