郭 楠,韓 雪，陸成偉,劉秀芬,郝繼龍

(吉林大學第一醫(yī)院 眼科中心，吉林 長春130021)

真菌性角膜炎是一種嚴重損害視力的眼科疾病，常在角膜外傷、角膜手術后、慢性眼表疾病、皮質類固醇激素局部應用、或佩戴隱形眼鏡等條件下發(fā)生，其感染源可為絲狀真菌或酵母菌等。臨床表現(xiàn)為角膜邊緣羽狀浸潤，伴或不伴表面隆起，角膜上皮可完整但存在深基質浸潤、衛(wèi)星灶、內皮斑等，抗生素治療無效或皮質類固醇激素治療后病情惡化等均可提示真菌性角膜炎。包括角膜病灶樣本涂片鏡檢及培養(yǎng)在內的微生物學診斷方法仍是診斷的金標準，近年來發(fā)展迅猛的分子診斷學方法也逐漸地應用于真菌性角膜炎的診斷，為早期診斷及治療爭取了寶貴的時機。

目前已知的可致真菌性角膜炎的病原菌有56個菌屬，105種真菌[1]。由于早期真菌性角膜炎患者有徹底治愈的可能，因此對于疑似真菌性角膜炎患者，臨床工作者應盡早明確診斷[2]。除結合臨床特征性表現(xiàn)外，包括涂片鏡檢、培養(yǎng)基培養(yǎng)等傳統(tǒng)微生物鑒定方法仍為真菌性角膜炎診斷的金標準。近年來，分子生物學診斷方法發(fā)展迅速，為真菌性角膜炎的診斷提供了新的方向，也使早期診斷、早期治療得以實現(xiàn)。以下將傳統(tǒng)及新興診斷手段均做簡要闡述。

1 傳統(tǒng)檢查手段

1.1 角膜組織涂片檢查

角膜組織涂片檢查可通過觀察鏡下真菌菌絲或孢子形態(tài)特征來初步診斷真菌性角膜炎。常用染色方法包括10%KOH濕片法、革蘭染色法及姬姆薩染色法等[3]。KOH濕片法快速而廉價，是涂片檢查最常用的方法之一，它用于檢測真菌的靈敏度為61-94%，特異性為99.7%。此外，革蘭染色的敏感性在36-50%之間。乳酸酚棉蘭染色敏感性為85%，特異性為90%[4]。角膜組織涂片檢查簡便、快速、廉價，對于真菌性角膜炎高發(fā)、檢查技術及設備相對落后的國家及地區(qū)，不失為一種價值較高的診斷方法。但真菌感染灶通常位于深層基質中，易受取材方法及部位的影響，導致角膜刮除樣本中病原體含量較低，使漏診率明顯增加。此外，檢查人員的主觀性差異，也對檢查結果有一定影響[5]。

1.2 真菌培養(yǎng)法

在嚴重的真菌性角膜潰瘍和疑似真菌性角膜炎病例中，真菌培養(yǎng)仍是必要的診斷步驟。最常見的培養(yǎng)基為沙堡弱(Sabouraud dextrose agar,SDA)培養(yǎng)基、血瓊脂(BA)培養(yǎng)基，非首診真菌性角膜炎真菌培養(yǎng)法的陽性率為58%[6]。酵母菌培養(yǎng)周期在24-48 h，而絲狀真菌培養(yǎng)周期平均在2-4 d，某些真菌培養(yǎng)周期可能較長(1wk-3wk)，如鐮刀菌等。真菌培養(yǎng)具有高度專一性，培養(yǎng)結果陽性仍是診斷的金標準[3]。但缺點是培養(yǎng)周期較長，敏感性較低，導致診斷延遲、錯過了最佳治療時機、增加了手術幾率。此外，若在標本獲取前，患者已接受了經驗性的治療，可導致假陰性結果的出現(xiàn)[7]?；铙w共聚焦顯微鏡(in vivo confocal microscopy,IVCM)活體共聚焦顯微鏡可在顯微結構水平上對角膜組織進行實時成像，分辨率為1微米，可檢測到體積為數(shù)微米或更大的微生物有機體，如真菌菌絲等[8]。目前有研究表明，針對真菌性角膜炎患者，活體共聚焦顯微鏡敏感性約94%[9]。IVCM檢查的優(yōu)點包括無創(chuàng)、可于早期對真菌性角膜炎進行診斷、感染深度的確定、治療效果的評估與指導等。但這項檢查要求檢查人員具備豐富的檢查經驗；患者配合度不佳及運動偽影均會影響檢查結果；致密的角膜浸潤灶或疤痕也會影響組織的滲透性和可視性[10]。此外，IVCM無法檢測體積較小的生物體。同時，這項技術的成本相對較高，在經濟條件較差的地區(qū)，其普及應用收到了限制，許多醫(yī)療機構很難獲得足夠的經驗來使用共焦顯微鏡。

2 分子診斷學

2.1 PCR相關技術

2.1.1聚合酶鏈反應 ( Polymerase Chain Reaction,PCR)

聚合酶鏈反應是一種能將特定的DNA片段放大擴增的分子生物學技術手段，可在生物體外的對DNA進行復制，將微量的DNA樣本大幅增加。由于PCR技術可在體外對待測基因進行成倍的擴增，目前正在越來越多地應用于病原體感染的早期診斷[11]。相較于真菌性角膜炎傳統(tǒng)診斷方法而言，PCR技術具有反應迅速、所需臨床樣本量小的優(yōu)勢。但是在利用PCR技術對致病性DNA進行擴增的同時，也可對非致病性DNA進行擴增，則會導致過度診斷發(fā)生[12]。

2.1.2多重PCR (multiplex PCR)

多重PCR，又稱多重引物PCR或復合PCR，是一種在同一PCR反應體系內加上二對或二對以上引物，以同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同，但可產生多個PCR產物，用于多種病原菌的同時檢測或鑒定，或對同種菌屬的分型鑒定。Dan He等人的研究中，利用多重PCR方法可同時對茄病鐮刀菌、煙曲霉菌及光滑酵母菌三種真菌進行檢測。與真菌培養(yǎng)相比，多重PCR技術可同時對樣本中多種病原體進行檢測，具有簡單、快速、專一性強、穩(wěn)定性高、可重復性強等優(yōu)勢[11,13]。

2.1.3實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)

實時熒光定量PCR是一種可以對PCR反應進程實時監(jiān)測的技術[14]，其原理是在PCR反應體系內加入熒光報告基團，隨著反應的進行、PCR擴增產物不斷積累，熒光信號也相應逐漸增強，從而實現(xiàn)實時監(jiān)測整個PCR反應過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，可推斷出模板最初的含量[15]。此前董鐸等人報道了茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌及串珠鐮刀菌的實時熒光PCR方法，敏感性高，檢測的靈敏度可達1pg級,為臨床真菌性角膜炎鐮刀菌感染的診斷提供了一種快速準確的方法。相較于普通PCR技術而言，實時熒光定量PCR在反應體系中加入了熒光基團，通過對熒光信號進行檢測，較電泳檢測靈敏度高；其次，利引物和熒光基團同時與待測模板特異性結合，提高了PCR反應的特異性；另外，通過對熒光信號的檢測，可對反應進程實時監(jiān)測、準確定量[16,17]，但該實驗方法所需實驗成本偏高。

2.1.4巢式PCR(nest-PCR)

巢式PCR，或稱嵌套PCR，是一種利用兩套PCR引物對，先后進行兩輪PCR反應，從而擴增完整的目的基因片段的PCR手段。在第一輪反應中，外引物用以產生擴增產物，此產物在在內引物的存在下進行第二輪擴增，得到小于第一次擴增產物的PCR產物片段[7]。而半巢式PCR與巢式PCR不同之處在于，在第二輪反應中，僅替換第一輪反應引物對中的一個，而保留另一個引物。在Parisa Badiee等人的研究中，納入38例疑似真菌性角膜炎病例，結合角膜組織涂片檢查、真菌培養(yǎng)、PCR及對抗真菌藥的反應，其中28例診斷為真菌性角膜炎，巢式PCR檢查結果與其匹配度(包括陽性率及陰性率)為81.6%，而KOH濕片法、革蘭氏染色法及真菌培養(yǎng)的匹配度分別為76.3%，42.1%，68.4%。Haghani I等利用半巢式 PCR 對真菌性角膜炎進行診斷，陽性率可達 27.5%，而 KOH 濕涂片為10%，鈣熒光白染色為25%，真菌培養(yǎng)為17.5%；敏感性分別為：KOH濕片法為28.5%，KOH濕片法聯(lián)合鈣熒光白染色為42%，半巢式PCR為57.1%；特異性分別為：KOH濕片法為94%，鈣熒光白染色為78.7%，半巢式PCR為78.7%。可見，巢式PCR及半巢式PCR采用兩個引物對、兩輪PCR反應，提高了檢測的靈敏度。但也因為兩輪反應，中途需開蓋處理，增加了污染的機會[18-20]。

2.1.5直接PCR(Direct PCR)

傳統(tǒng)PCR方法均需經過DNA提取步驟，而DNA提取過程不僅耗費時間，而且還受到樣本中致病病原體含量較低、提取過程中DNA模板丟失等條件的限制。而直接PCR通過將樣本加無菌水混勻后，隨后抽取部分含有樣本的溶液直接用于PCR反應。無需提取DNA樣本而直接進行PCR。直接PCR反應的關鍵因素為特殊的DNA聚合酶，即使樣本背景復雜、病原體含量極低，也可獲得良好的PCR結果。Zhao等人的研究顯示，利用直接PCR方法對80份角膜刮片進行檢測，其中66例結果陽性，總檢測出率達82.5%。對34名高度懷疑真菌性角膜炎的患者，直接PCR的陽性率為84.8%。將重復的角膜刮片剔除后，陽性率增加到91.2%，顯著高于培養(yǎng)基培養(yǎng)35.3%、涂片直接鏡檢64.7%， (P<0.001)，及共聚焦顯微鏡74.1%。直接PCR和真菌培養(yǎng)診斷感染性角膜炎的敏感性分別為98.0%和47.1%(P<0.001)，而特異性分別為81.8%和100%。另外，完成整個直接PCR過程僅需3 h[21]。直接PCR方法是一種新興的診斷技術，省略了DNA提取步驟，大大縮短了檢測所需時間，且感染性角膜炎具有高度敏感性和特異性，這種診斷方法對于及時制定有效的診療方案具有非常重要的意義。

2.1.6新一代測序技術(next-generation sequencing,NGS)

第一代DNA測序技術，包括傳統(tǒng)的化學降解法、雙脫氧鏈終止法及以其為基礎的各種DNA測序技術，其中由于操作簡便，Sanger法應用最為廣泛。而新一代測序技術，又稱為高通量DNA測序技術，相較于第一代DNA測序技術而言，可實現(xiàn)一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子序列測序。Zhi gang Li等人在一項回顧性研究中，利用新一代測序技術對16例感染性角膜炎患者及4個固定于福爾馬林內的角膜樣本進行分析，應用了Kraken及Centrifuge兩種宏基因組學分類引擎分析基因序列，成功鑒定了大多數(shù)患者的真菌、細菌及阿米巴病原體[22]。在病原微生物的檢測方面，通過NGS技術可以獲得病原微生物的序列信息，甚至可以鑒定到種，與傳統(tǒng)真菌檢測方法相比較，大大縮短了鑒定所需的時間，為早期診斷及針對性用藥提供了可能。但由于目前Genbank數(shù)據(jù)庫對致病性病原菌基因序列收納尚不完整，一些基因目前仍無法比對，另外該項技術所需實驗條件及設備要求均較高，對于基層醫(yī)院推廣應用尚存在很大難度[22-24]。

2.2 DNA指紋技術(DNA Fingerprinting)

DNA指紋技術，即在分子水平上對DNA多態(tài)性進行研究，從而對致病性病原微生物分類鑒定的技術。目前用于真菌鑒定的DNA指紋技術包括限制性片斷長度多態(tài)性分析(restricted fragment length polymorphism,RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA分析(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴增片斷長度多態(tài)性分析(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)或溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)、單鏈構象多態(tài)性技術(single-strand conformation polymorphism,SSCP)等[7]。

2.2.1RFLP技術 RFLP技術是最早應用的DNA標記技術。對于不同來源的DNA，其特異限制性酶切位點分布不同，選擇合適限制性內切酶酶切后，可得到長短不等的一系列片段，進行電泳、與標記的探針雜交放射自顯影后，便可得到RFLP圖譜。對酶切片段大小、數(shù)量以及構型差異進行分析，從而揭示DNA序列水平上的多態(tài)性。RFLP技術具有穩(wěn)定性高、重復性好的特點，但操作過程復雜，耗費時間較長，且存在放射性危害[25]。

2.2.2RAPD技術 是一種以PCR為基礎的分子標記技術。其原理為利用隨機引物對DNA片段進行非定點PCR擴增[26]，隨即進行凝膠電泳，可對擴增片段的多態(tài)性進行分析，進而得知DNA基因組相應區(qū)域的多態(tài)性。RAPD技術操作較簡單，避免了RFLP技術中Southern雜交操作，且無需知曉DNA基因組序列信息，僅利用一套引物即可對不同菌種進行鑒定，但該技術對實驗條件及設備的依賴性較大，重復性相對較差。

2.2.3AFLP技術 AFLP技術是RFLP技術及PCR技術相結合的分子標記技術，其原理是利用一種稀有位點的酶及一種多切酶對DNA基因組進行酶切，接著利用與兩種限制性內切酶相對應的雙鏈接頭與DNA片段連接，最后應用與接頭識別的引物對其進行擴增，最后利用聚丙烯凝膠電泳對得到的DNA片段進行分離，從而得出AFLP指紋圖譜。利用AFLP技術可檢測出親緣關系較近的DNA樣品中細微的差異，具有較高的穩(wěn)定性及可靠性。同時避免了RFLP操作復雜、有放射性危害及RAPD穩(wěn)定性差等缺點[27,28]。

2.2.4DGGE技術 是利用含有濃度線性遞增變性劑的聚丙烯酰胺凝膠電泳，將具有不同堿基序列但具有相似長度的雙鏈DNA分離的分子標記技術[29]，對于長度相似或相同，而堿基組成的雙鏈DNA片段而言，其所需解鏈溫度不同，所需的變性劑濃度也不同。在由低到高濃度線性梯度的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，隨電泳進行，DNA雙鏈片段在所需變性劑濃度位置處解鏈但不徹底分離，解鏈程度增大導致遷移阻力增大，當與電場力相平衡時，DNA分子不在電場中移動，由此形成圖譜。借助DGGE技術，可將相同長度的雙鏈DNA 片段分離，從而達到鑒別的目的。DGGE技術具有檢測率較高，結果穩(wěn)定等優(yōu)點，但其并不能確定基因組中突變的位點，需借助其他分子學方法進一步分析[30]。

2.2.5SSCP技術 是利用單鏈DNA構象的多態(tài)性分析DNA單鏈堿基突變的一種分子標記技術。當靶基因片段中發(fā)生堿基突變(如堿基插入、改變、缺失等)時，DNA單鏈構象發(fā)生改變，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，長度相同但構象不同的DNA單鏈即呈現(xiàn)出構象多態(tài)性。該技術簡單、靈敏、易于操作等特點，但仍需通過測序技術得知基因突變的位點及類別[31,32]。

2.3 核酸分子雜交技術

是一種基于堿基互補配對的原則，在一定條件下使靶基因變性、復性，并利用特異探針與靶基因核酸單鏈雜交為雙鏈，從而對病原體進行檢測的技術[33]。核酸分子雜交技術按反應條件又分為固相、液相雜交、原位雜交。固相雜交為將待測單鏈核酸結合到固相支持物上，隨后放入含有標記探針的雜交液體中進行雜交，雜交雙鏈便留在固相支持物上。原位雜交技術是以已知序列的特定標記核酸分子作為探針，與常規(guī)方法獲取標本中病原體核酸進行雜交，無需提取DNA即可檢測有無病原體感染的方法，但相較于其他分子診斷方法，其敏感性較低。與PCR技術相結合的反向斑點雜交技術，即PCR-RLB技術，則大大提高了檢測的敏感性[34]。

2.4 基因芯片技術(Gene Chip)或稱DNA微陣列技術(DNA microarray)

是在反向斑點雜交的基礎上，將大量靶基因的探針有順序的、高密度的排列固定在同一固相支持物上，稱為基因芯片。可實現(xiàn)同時對大量待測片段進行檢測，大大縮短了臨床診斷所需時間。但基因芯片制作成本較高，且所需檢測設備昂貴，使其應用局限于實驗室內，未能廣泛應用于臨床病原微生物檢測[11]。

2.5 質譜檢測技術(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)

近年來，質譜技術飛速發(fā)展，其中基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術是近年來新興的一種軟電離質譜技術，利用儀器軟件繪制菌種的蛋白質譜峰圖譜，并與已知病原菌標準蛋白質指紋圖譜數(shù)據(jù)庫比對，從而達到鑒定的目的[35]。 MADLI-TOF MS技術具有快速、靈敏、準確、高通量等特點，但由于目前已知微生物蛋白質指紋圖譜數(shù)據(jù)庫仍不完善，導致一些少見菌種的鑒定較為困難；對于樣本處理辦法的不同，并無同一的標準，導致實驗結果的可重復性不高；若為同一菌屬中較為相近的菌種，易導致鑒定錯誤。因此，我們需要繼續(xù)完善數(shù)據(jù)庫，規(guī)范樣本預處理辦法，同時與其它診斷方法相結合，以最大程度地發(fā)揮質譜技術的效用[36]。

2.6 環(huán)介導等溫擴增法(loop mediated isothermal amplification,LAMP)

是一種全新的核酸擴增技術，該技術在恒定溫度下即可特異地將DNA片段擴增至109個拷貝，耗時多在1 h內。 其原理為對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而保證靶基因片段高效、快速、特異地擴增[37]。雖然引物設計與選擇相對較復雜，但與常規(guī)PCR核酸擴增方法相比，LAMP四種引物需與位點完全匹配才能進行擴增，特異性較強；LAMP所需擴增模板為10拷貝或更低，靈敏度較高，但也因此非特異性擴增導致的假陽性率也隨之升高；恒溫擴增反應避免了PCR過程中變溫耗時，確保反應可在較短時間內完成；另外，LAMP反應無需昂貴的PCR反應儀，降低了實驗成本；此外，LAMP產物檢測可通過直接觀察或熒光檢測等方法，步驟簡潔。以上優(yōu)勢使LAMP擁有較廣闊的應用前景[38,39]，但LAMP僅能對片段較小的短鏈DNA進行擴增，無法擴增較長的DNA片段，此外，由于該反應靈敏度較高，過程中易受污染物的影響而呈現(xiàn)假陽性的結果。

2.7 滾環(huán)擴增(Roiling Circle Amplification,RCA)

是一種近年來新興的核酸擴增技術，其本質為以連接酶連接、引物延伸與鏈置換擴增反應為基礎的一種恒溫核酸擴增方法。其原理為以環(huán)狀DNA為模板，在DNA聚合酶的催化作用下，使一個較短DNA引物沿模板鏈延伸、擴增，將dNTPs結合為包含大量重復的模板互補片段的單鏈DNA。這種方法可以通過簡單、有效的過程實現(xiàn)對靶核酸的信號放大，不失為一種核酸檢測的理想手段。除此以外，通過RCA技術，還可實現(xiàn)對包括RNA、SNP、蛋白質、病原體及病變細胞等目標進行檢測[40,41]。具有高度特異性，操作簡便及靈敏度較高的優(yōu)點。但RCA技術也存在一定的制約，如鎖式探針連接效率、背景信號干擾、拓撲結構的制約等等，仍需進一步解決[42]。

2.8 重組酶聚合酶擴增術(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)

被稱為可以替代PCR的核酸擴增技術。RPA作為另一種等溫核酸擴增技術，通過模擬DNA體內擴增的過程，在37℃-42℃條件下，利用重組酶和單鏈結合蛋白協(xié)同實現(xiàn)引物和模板的特異性結合，從而實現(xiàn)核酸片段成指數(shù)擴增。作為一種新興的恒溫擴增技術，該技術具有快速、成本低、操作簡單的特點，已逐漸應用于病原體檢測領域，但仍存在一些不足，如其應用的探針及引物較特殊，使得RPA技術僅適用于長序列核酸分析等[43,44]。

上述分子診斷方法各有其優(yōu)勢，但大多需提前進行DNA模板提取。因此，實驗室環(huán)境污染、操作不當則導致假陽性問題出現(xiàn)；此外，真菌性角膜炎組織樣本內病原體量較少，若刮除方法不當、運輸措施不當，經過DNA提取，則極易出現(xiàn)假陰性問題。實驗所需儀器、設備以及有經驗的操作人員，均給分子診斷方法在基層醫(yī)療機構的普及帶來了障礙。因此，我們仍需作出更大的努力，使其朝著無需提取DNA模板、簡化實驗操作步驟及所需條件、檢測結果的可視化等方向發(fā)展。

真菌性角膜炎是一種全球分布的致盲性眼病。就診斷方法而言，雖然直接鏡檢及培養(yǎng)的敏感性不高，但仍為診斷真菌性角膜炎的金標準，除此以外，例如共聚焦顯微鏡、各式各樣的分子診斷學方法如PCR相關技術、新一代測序技術、DNA指紋技術、核酸分子雜交技術、基因芯片技術、質譜檢測技術、LAMP、RCA、RPA等也為診斷提供了新的方向，節(jié)約了診斷時間，提高了檢出率，有望使真菌性角膜炎得到早期診斷和及時治療。