● 侯麗瑩 鄧麗玲 羅 佩 楊正望 熊 芬 胡齊欣 余曦明▲

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種極為復雜的疾病，涉及內分泌、生殖、代謝疾病等多個方面，隨著其發(fā)病率的日益增加，越來越受到人們的重視。由于其稀發(fā)排卵或者無排卵、卵子質量差等多種因素導致不孕，困擾了大多數(shù)有生育期望的PCOS患者。既往對于PCOS患者不孕問題的研究主要重點在于如何促進排卵、降低雄激素水平，相關實驗研究PCO大鼠也多集中在觀察卵巢、外周血的變化。雖然取得了一定的療效，但早期研究就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過藥物治療、糾正不排卵的因素后，排卵率確實得到提升可達至80%，但最終妊娠率維持在40%～50%之間，失敗率可高達50%[1]。隨著研究的深入，越來越多的學者認為除了卵巢排卵方面的異常導致PCOS患者不孕，子宮內膜容受性降低也是其不孕和妊娠成功率較低的重要原因。子宮內膜發(fā)育及胚胎容受性障礙，是影響PCOS患者生育力低下，且妊娠結局不良的因素之一。因此，如何提高子宮內膜容受性成為婦產(chǎn)科相關的研究熱點和重點之一。

PCOS的中醫(yī)藥治療以補腎化瘀為主要目標進行攻關，既往實驗研究發(fā)現(xiàn)補腎化瘀方對PCOS患者卵巢局部微環(huán)境有改善作用[2]。隨著認識的深入，我們前期臨床研究表明補腎化瘀方可提高著床期子宮內膜的容受性[3]，而且研究表明CT參與子宮內膜容受性形成，且以多種機制參與胚胎著床[4]。為進一步探討動物實驗相關機制，本實驗通過觀察補腎化瘀方對子宮內膜CT表達的影響，進一步研究其可能改善子宮內膜容受性的作用機制。

1 材料與儀器

1.1動物選用21 d 健康雌性SD大鼠，SPF級，共100只，體量為(75±15)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK(湘)2011-0003。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室，許可證號為SYXK(湘)2013-0005。室溫20～26℃，相對濕度為40%～60%，保持通風干燥，維持晝夜節(jié)律，每天光照10小時，架式分籠，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2藥物、試劑與儀器補腎化瘀方：紫石英15g，補骨脂8g，菟絲子8g，桑寄生8g，茺蔚子5g，澤蘭8g，澤瀉8g，土鱉蟲8g，三七3g，覆盆子8g，蓮子心3g，甘草3g，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供。取生藥85 g，浸泡于水中30 min，加熱沸騰后小火微沸30 min，分取藥液，濾渣再次加水煎30 min，兩次藥液合并，紗布過濾，置入水浴鍋中，濃縮后藥液濃度為生藥含量0.9 g/ mL，分裝無菌小瓶，4℃冰箱保存。

炔雌醇環(huán)丙孕酮片(商品名：達英-35)拜耳醫(yī)藥保健公司廣州分公司提供，批準文號：國藥準字J201401114，21片/盒，生產(chǎn)批號：20100003。 DHEA粉末：純度99.16%，購自湖北芳通藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號為：20120518。注射用大豆油：購自蘇州捷易龍貿易有限公司，生產(chǎn)批號：Y12080204-3-07。

托盤式天平(上海精密儀器儀表有限公司YPN60)、低溫高速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司TD6-WS)，恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)、輪轉石蠟切片機(德國LEIKA儀器有限公司RM2235)、脫水機及包埋機(武漢俊杰電子有限公司)、生物組織攤片機(浙江金華市金迪醫(yī)療設備廠金迪YD-A)、海爾電冰箱(青島海爾股份有限公司BCD-226SKA)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造商有限公司一恒DNP-9162)、掃描電子顯微鏡(日本日立公司)、離子濺射儀(日本日立公司)、凍干機(日本日立公司)、Motic BA410研究型顯微鏡(廈門麥克迪奧集團公司)、Motic Images Plus6.0計算機圖像分析系統(tǒng)(廈門麥克迪奧集團公司)。

2 方法

2.1 PCO大鼠模型的制備與評價參照張曉薇、李燕等[5-6]造模方法，由于每天每只大鼠均需稱量不等的DHEA單獨配制不同濃度的注射液，在此基礎上對DHEA注射液的配制進行調整，按DHEA6mg/(100g體重·d)+0.2mL注射油劑(大豆油)來換算，100g體重大鼠應配制注射液濃度為6mg/0.2mL，即30mg/mL，將此作為DHEA注射液的標準濃度，注射量按0.2mL/100g體重來計算，保持注射液濃度恒定，配制DHEA溶液酒精燈加熱溶解均勻后，按不同大鼠重量抽吸不同體積的注射液?？瞻讓φ战M30只，予頸背部皮下注射2mL/kg注射用大豆油劑，并輕輕揉按促進吸收。模型制備組70只予DHEA 0.06g/(kg·d)+0.2mL注射用大豆油劑，配制溶液方法如前所述，頸背部皮下注射，并輕輕揉按促進吸收，兩組給藥于每日上午十點同期進行。經(jīng)測量，從23～43d，SD雌性大鼠體重約為60～210g，注射量在0.12～0.42mL之間浮動。定期觀察攝食、毛發(fā)及精神、一般活動情況，注射10d后開始每天下午4時進行1次陰道脫落細胞學檢查，用光滑吸管吸取少量生理鹽水，沖入大鼠陰道內，吸取少量陰道液，涂于載玻片上直接光鏡觀察，觀察其動情周期變化。依照文獻中陰道脫落細胞學特征，確定動情周期，大鼠動情周期可分為前期、間期、動情期、后期，主要取決于白細胞和核上皮細胞的多少以及有無角化細胞的形成來判別，間期白細胞(大量)>后期(約1/3)>動情期(無)，而前期主要為核上皮細胞，動情期角化細胞數(shù)目增多[7]。注射10d后每天下午4時進行1次陰道脫落細胞學檢查，模型制備組鏡下可見大量白細胞，動情間期時間變長，打破了周期的規(guī)律性，提示構建模型后，由于病理的改變影響到PCO大鼠，從而出現(xiàn)卵巢功能的異常，進一步表現(xiàn)為間期為主的變化；空白對照組可出現(xiàn)正常的周期次序。注射第20d當晚20時禁食，第21d晨起各組隨機抽取10只大鼠，稱重后頸椎脫臼法處死，頸動脈采血，抗凝采血管采集，離心后用移液器取上清液，用放免法檢測血清激素LH、FSH、T、P、E2，按放免試劑盒說明操作，采血后解剖雙側卵巢，以卵巢最大平面作為待檢平面石蠟包埋，HE染色后顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)學變化，判定造模是否成功。

2.2給藥干預方法判定造模成功后，模型制備組大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為三組，分別是模型對照組、補腎化瘀方組、達英-35組各20只，加上空白對照組20只，共80只。補腎化瘀方組每日按時予補腎化瘀湯劑灌胃，1次/ d，給藥劑量[8-9]按成人女性平均體重60kg體表面積換算，折合到大鼠用藥劑量8.8 g/(kg·d)，結合“1.2”所述中藥湯劑濃度即10mL/(kg·d)；達英-35組每天灌服達英-35溶液，人用藥量為1片/d，折合大鼠約為0.101片/(kg·d)，即0.00023g/(kg·d)，將1片達英-35溶于100mL蒸餾水中，約為10mL/(kg·d)；空白對照組以與模型對照組同等量的蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃21d，停藥7d為1個周期，共給藥3個周期。停藥5天后按雌雄鼠1∶1的比例交配，次日清晨檢查大鼠陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓日記為妊娠第1日。

2.3標本采集與指標測定妊娠第四天清晨以頸椎脫臼法處死大鼠，剖取大鼠子宮及雙側卵巢，將其表面脂肪去除干凈后，均以4%多聚甲醛固定，卵巢HE染色后在顯微鏡下形態(tài)學觀察。子宮內膜行免疫組化法檢測CT表達。按照試劑盒說明書進行，工作濃度為1：100，以細胞質中有棕黃色或者棕褐色顆粒出現(xiàn)為陽性表達。切片置于400倍高倍鏡下觀察，每張切片隨機選擇觀察5個高倍鏡視野，對每張照片進行分析，采用Motic Images Plus 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)對結果進行分析，以切片背景的灰度值作背底校正，測定平均光密度值(average optical density，AOD)。

3 結果

3.1大鼠卵巢形態(tài)組織學空白對照組大鼠肉眼觀見卵巢色澤較紅潤，HE染色光鏡下可見多個處于不同生長層次的卵泡，且細胞排列整齊，多層次的變化，可多達8～9層。模型制備組大鼠肉眼觀見卵巢表面蒼白，包膜增厚，隱約可見擴張的囊泡，光鏡下可見囊狀卵泡，水泡樣改變，空腔增大，卵泡內可見卵母細胞及放射冠消失，顆粒細胞層數(shù)減少，排列較為疏松，提示PCO大鼠卵巢組織結構病理改變與患者PCOS臨床表現(xiàn)一致，結合“2.1”動情周期變化結果以動情間期為主，失去規(guī)律性，提示PCO大鼠模型造模成功。見圖1。

A.空白對照組 B.模型制備組

3.2大鼠血清性激素水平比較造模后對兩組血清性激素水平進行統(tǒng)計分析，單因素方差分析出的結果表明：空白對照組大鼠血清T水平明顯低于模型制備組(P<0.01)，E2水平高于模型制備組(P<0.01)，兩組在FSH、LH、P水平上結果提示無顯著差異(P>0.05)。提示造模成功。見表1。

表1 兩組大鼠血清性激素水平比較

注：與空白對照組比較，△P<0.01。

3.3各組大鼠子宮內膜CT表達的結果與空白對照組比較，補腎化瘀組、模型對照組、達英-35組CT表達強度降低(P<0.01)；與模型對照組比較，補腎化瘀組、達英-35組CT表達強度增高(P<0.01)。見表2。

組 別nCT平均光密度值空白對照組200．557±0．695模型對照組200．278±0．120△補腎化瘀組200．390±0．059△★達英-35組200．332±0．058△★

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與模型對照組比較，★P<0.01。

A.空白對照組；B.模型對照組；.C.補腎化瘀方組；D.達英-35組

圖2各組大鼠子宮內膜種植窗期CT的表達(免疫組織化學法×400)

4 討論

PCOS的模型建立有多種，既往實驗研究報道[5-6]，運用DHEA造模方法成功誘導在內分泌及卵巢形態(tài)學方面與人類PCOS患者相似的大鼠模型，并且發(fā)現(xiàn)模型大鼠同時伴有空腹血糖增高及高胰島素血癥，認為此種動物模型下丘腦-垂體-卵巢軸保持完整，是一種研究PCOS內分泌及卵巢病理改變的理想模型。因此本實驗采用較為經(jīng)典的DHEA誘導PCO模型的建立。

前期預實驗提示DHEA誘導PCO大鼠模型可行。本研究在預實驗基礎上，以DHEA構建的PCO大鼠模型作為研究對象，觀察大鼠動情周期、卵巢顆粒細胞形態(tài)轉變以及PCO大鼠血清性激素水平的變化，結果顯示：造模后，模型制備組肉眼觀顏色較為蒼白，鏡下存在多個呈囊樣擴張的形態(tài)不規(guī)則的空卵泡，卵巢顆粒細胞排列紊亂且呈多囊樣改變，動情周期失去規(guī)律變化，血清T水平明顯較高，血清E2水平明顯較低，符合人類PCOS血清性激素變化。因此本模型無論是從卵巢形態(tài)學變化還是從內分泌改變進行評價，都是一種較為理想的PCOS動物模型。DHEA誘導的PCO大鼠模型更符合我們的實驗要求。

精子與卵子的結合促使了胚胎的發(fā)生，在人類胚胎著床成功是一個復雜的程序化過程，任何一個環(huán)節(jié)異常都可能導致胚胎丟失或者著床失敗[10]。胚胎的質量及發(fā)育潛能、子宮內膜容受性及子宮內膜局部微環(huán)境等都可影響生殖過程。其中子宮內膜容受性是指子宮內膜的一種狀態(tài)或者可以稱之為接受能力，子宮內膜容許胚胎定位、黏附并植入其中，達到能夠準備接受胚胎植入的狀態(tài)。其受到嚴格的時空限制，這個短暫特定的敏感時期，常稱作“種植窗口期”，大約在排卵后的6～9d，或者月經(jīng)周期的第20～24d[11]。這個關鍵時期，若內膜與胚泡發(fā)育同步才能達到子宮內膜容受性較為良好的狀態(tài)，才能夠順利著床，否則就會著床障礙。因此，如何提高子宮內膜容受性，促進子宮內膜與受精卵的發(fā)育同步性，成為婦產(chǎn)科領域研究的焦點。隨著PCOS發(fā)病率日益上升，其生殖問題也是研究焦點中重點關注方面之一。PCOS患者的突出問題是生殖障礙，與其他癥候群相互影響，內分泌紊亂、胚胎發(fā)育潛能受損、子宮內膜容受性的降低都可能導致其生殖障礙[12]。促排卵是一直以來的重點之一，而如何改善PCOS患者子宮內膜容受性是近年的熱點方向，中西醫(yī)都為此進行不斷地探索。

早在1994年，就有學者發(fā)現(xiàn)CT在子宮內膜“種植窗”的形成中起著重要作用[13]。隨著研究方法和技術手段的更新，降鈣素多機制調節(jié)子宮內膜容受性，促進胚胎的植入與發(fā)育，為不孕不育的治療提供新的靶點。降鈣素是一種肽類激素，主要是通過甲狀腺濾泡旁細胞合成和分泌。研究發(fā)現(xiàn)子宮能夠合成極少量的降鈣素，雖然低于甲狀腺合成的CT，但是子宮通過自分泌、旁分泌兩種途徑控制鈣離子的平衡從而調節(jié)植入時子宮容受狀態(tài)[14]。降鈣素能夠特異性表達于種植窗期子宮內膜，被認為是在這段敏感的短暫時期最有價值的生化標志物[15]，本研究顯示CT主要表達于子宮內膜腺上皮細胞中，與空白對照組比較，模型制備組CT表達下降，提示子宮內膜容受性下降可能與CT表達異常有關。

中醫(yī)認為“腎為先天之本”，主生殖，腎精充盛可促進精卵的發(fā)育、內膜的長養(yǎng)。若腎氣不足，或后天失于養(yǎng)護，精血匱乏，血海無以盈溢，則天癸泌至及沖任通盛受到影響，導致月經(jīng)量少、閉經(jīng)、不孕等。若腎陰不足，癸水不充則精卵、內膜失滋致精卵不能發(fā)育或發(fā)育不全；若腎陽不足，氣化無力則精卵發(fā)育長養(yǎng)動力不足。腎虛引發(fā)腎陰腎陽的失調，從而導致腎陰失滋，腎陽失化致無排卵、排卵障礙。PCOS的病因病機復雜，變化多端，以腎虛為本，可兼見脾虛、肝郁、痰濕、血瘀等，故補腎乃為治法之根本。PCOS由于腎虛涉肝及脾而生痰濁、瘀血，同源互衍，相互影響。元代朱丹溪首次提出：“痰挾瘀血，遂成窠囊?！庇纱丝梢钥闯觥梆觥钡牟±碜兓cPCOS病理結局類似。本研究采用導師多年來治療PCOS的基礎方補腎化瘀方，從補腎化瘀的角度出發(fā)，取得了一定的療效。方中由紫石英、補骨脂、菟絲子、桑寄生、茺蔚子、澤蘭、澤瀉、土鱉蟲、三七、覆盆子、蓮子心、甘草組成。其中紫石英，取甘溫之性溫補肝腎，暖宮助孕，正如《神農(nóng)版本草經(jīng)》謂其可“補不足，女子風寒在子宮，絕孕十年無子”；補骨脂以滋補腎陽為主，具有雌激素樣作用，《本草疏經(jīng)》謂其：“暖水臟，陰中生陽，壯火益土之要藥也?！倍吆嫌茫B(yǎng)腎陰，化腎陽，陰陽互根，腎精充足，共為君藥。菟絲子能夠補腎精，性偏平和，陰陽雙補，陰中有陽，守而能走；桑寄生滋補精血，覆盆子具補益腎中元陽之能，滋養(yǎng)陰精之效，二者均歸肝腎二經(jīng)；蓮子能夠交通心腎，清心安神，可防溫燥之弊，茺蔚子具活血化瘀調經(jīng)功效。上均為臣藥。澤蘭、澤瀉破瘀血，活血利水；三七止血化瘀，祛瘀補正；土鱉蟲加強破血逐瘀之功；茺蔚子具活血化瘀調經(jīng)功效。上均為佐藥。甘草調和諸藥為使藥。全方補腎活血，化瘀調經(jīng)，對改善子宮內膜局部微環(huán)境有促進作用?，F(xiàn)代研究結果表明，補腎活血化瘀可能增加內膜厚度，改善子宮內膜血流狀態(tài)[16]。本研究中，與模型對照組比較，補腎化瘀方組子宮內膜的CT 表達上調，因此我們認為補腎化瘀方可上調子宮內膜上CT表達，可能是補腎化瘀方改善子宮內膜容受性的機制之一。

綜上所述，補腎化瘀方可在改善子宮內膜容受性方面產(chǎn)生積極作用，提示作用機制可能與上調子宮內膜CT表達有關。但影響子宮內膜容受性的相關生物活性因子及其他因素十分復雜，目前有部分研究較為深入的指標只能作為輔助，且中藥作用于子宮內膜容受性的機制尚不完全清楚，亟待進一步拓展更為深入的研究，為中醫(yī)藥在治療PCOS方面提供合理的科學依據(jù)。

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