劉曉峰，張 娜，王丹丹，姜沅彤，趙 巖

靈芝在日常生活中被人們廣泛使用，其所含三萜類(lèi)活性成分主要具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、保護(hù)心肌缺血、抗病毒、抑菌、保肝護(hù)肝、強(qiáng)心降壓、解痙平喘、止咳祛痰及抗腫瘤等藥理作用[1]。為探討不同溶媒提取是否對(duì)其活性成分靈芝酸A的藥動(dòng)學(xué)特性有影響[2-3]，本研究分別以水和乙醇為溶媒提取靈芝活性成分后給大鼠灌胃，采用高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中靈芝酸A的含量，計(jì)算相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為合理、有效選用溶媒提供參考，為臨床合理使用該類(lèi)藥品提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：雄性Wistar大鼠，體重260～280 g，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格許可證號(hào)：SCXK(吉)2008-0005。大鼠給藥前禁食12 h，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水。

1.2 藥品與試劑：靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品(上海原液生物科技有限公司，批號(hào)：20140305)，靈芝乙醇提取物，丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)品(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：20140517)，乙腈色譜純，甲醇色譜純，冰乙酸，95%乙醇，娃哈哈純凈水(杭州哇哈哈公司提供)。

1.3 儀器：LC3000型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)W-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，TG628A分析電子天平(上海皖衡電子儀器有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(北京國(guó)華醫(yī)療器械廠(chǎng))，AvantiTM J-301冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海美普達(dá)儀器有限公司)，冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：采用大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1 mL/min，流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰乙酸水，進(jìn)樣量20 μl。

2.2 專(zhuān)屬性考察：取大鼠空白血漿，含靈芝酸A和內(nèi)標(biāo)丙酸睪酮的對(duì)照溶液及處理后的生物樣品溶液，按照“2.1”條件進(jìn)行操作，結(jié)果見(jiàn)圖1(目錄后)。結(jié)果顯示，靈芝酸A和內(nèi)標(biāo)(丙酸睪酮)的保留時(shí)間分別為7.617、9.954 min，且血漿中內(nèi)源性等物質(zhì)不干擾靈芝酸A和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

2.3 溶液的配制

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制：分別取靈芝酸A和丙酸睪酮對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，以甲醇為溶劑，分別配制成濃度為10 μg/mL的溶液，備用。

2.3.2 供試藥品制備

2.3.2.1 水煎液制備：取靈芝子實(shí)體飲片250 g，加適量水浸沒(méi)藥材30 min，加8倍量水加熱煮沸10 min，轉(zhuǎn)入小火煎30 min，趁熱過(guò)濾，藥渣用同法提取2次，合并3次煎液，濃縮至干，備用。用時(shí)以適量水混懸，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3.2.2 醇提取液制備：取靈芝子實(shí)體飲片250 g，用60%乙醇浸沒(méi)藥材用索氏提取器提取，提取1 h后回收乙醇，濃縮至干，備用。用時(shí)以適量水混懸，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)：取Wistar大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，每組6只。分別灌胃水提取物和60%乙醇提取物高劑量組1 840 mg/kg、中劑量組920 mg/kg、低劑量組180 mg/kg。在給藥2、5、10、20、40、60、120、240、360、480、720、1 440 min后，眼后靜脈叢取血，收集于肝素化管中，37 ℃水浴保溫30 min，冷凍離心10 min(3 500 r/min)，取上清液進(jìn)行血藥濃度分析。給藥1 h后給大鼠供水。

2.5 血漿樣品處理：將“2.4”項(xiàng)下血樣離心，取0.1 mL血漿加入0.9 mL丙酸睪酮內(nèi)標(biāo)液(0.1 mg/mL)，5 000 r/min離心10 min，分離上清液，精密吸取上清液，置于2 mL離心管中，蒸干后用色譜甲醇定容至100 μl。用濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，待測(cè)。

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察：取空白大鼠血漿100 μl，制成相當(dāng)于靈芝酸A血漿濃度,分別為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的生物樣品，按“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行處理；進(jìn)樣20μl，以靈芝酸A系列對(duì)照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)軸(X)，以靈芝酸A與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(A

藥/A內(nèi)標(biāo))為縱坐標(biāo)軸(Y)，得校正曲線(xiàn)Y=2.1151x+0.2174，r=0.999 7(n=5)，結(jié)果表明血漿樣品中靈芝酸A在0.2～10 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.7 精密度與回收率試驗(yàn)：取空白大鼠血漿100 μl，分別加入一定量的靈芝酸A，配置成靈芝酸A濃度分別為0.2、2、10 μg/mL的低、中、高三個(gè)生物樣品。按“2.4”進(jìn)行處理，連續(xù)測(cè)定3 d的精密度，并以處理后的峰面積與未經(jīng)處理直接進(jìn)樣測(cè)得的色譜峰面積之比，考察生物樣品的回收率，見(jiàn)表1。

表1 靈芝酸A回收率與精密度試驗(yàn)

2.8 血漿藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)：按“2.4”項(xiàng)下以時(shí)間為橫坐標(biāo)，血藥濃度為縱坐標(biāo)，繪制藥-時(shí)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖2-圖3(目錄后)。

2.9 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析：將“2.8”項(xiàng)下的血藥濃度-時(shí)間用“3P97”藥動(dòng)學(xué)軟件擬合分析計(jì)算結(jié)果，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，大鼠灌胃靈芝酸A 水溶液、60%乙醇溶液提取物后其藥動(dòng)學(xué)行為符合二室模型。低劑量組除Lag time參數(shù)外，其他參數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在中劑量組，除Lag time參數(shù)外，其他參數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在高劑量組，除V/F參數(shù)外，其他參數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；可認(rèn)為60%乙醇溶液提的靈芝酸A參數(shù)，T1/2alpha、T1/2beta、AUC和T1/2Ka在各劑量組均高于水溶液提取，其他參數(shù)則有高有低。

表2 不同溶媒提取靈芝酸A的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注：*和水溶液提取組相比較，P<0.05。

3 討論

靈芝在日常生活中人們用其浸泡藥酒進(jìn)行保健，在中醫(yī)方劑中依據(jù)治療疾病的不同用于中藥藥物治療[4]，以及依據(jù)靈芝有效成分開(kāi)發(fā)有靈芝片、靈芝糖漿等[5-6]。從文獻(xiàn)可以看出在靈芝的使用過(guò)程中，不同溶媒的提取對(duì)靈芝中活性成分的有效、合理利用沒(méi)有任何依據(jù)。浸泡藥酒會(huì)不會(huì)因?yàn)榫浦幸掖紭O性大，提取物的濃度高導(dǎo)致生活中長(zhǎng)期使用蓄積中毒，中醫(yī)方劑中用于水煎煮有沒(méi)有完全提取靈芝有效成分達(dá)到治療作用。通過(guò)本研究的比較為水提取和乙醇提取，給靈芝使用提供了相應(yīng)參考。

研究通過(guò)比較靈芝水溶液、60%乙醇提取物給大鼠灌胃后大鼠體內(nèi)靈芝酸A的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃60%靈芝乙醇提取物高、中、低濃度后靈芝酸A在大鼠體內(nèi)的AUC分別為(601.109±6.012)μg/(mL·h)、(541.847±5.892)μg/(mL·h)、(506.739±5.789)μg/(mL·h)，經(jīng)過(guò)與水提取物給大鼠灌胃后AUC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果說(shuō)明60%乙醇提取物給大鼠灌胃后靈芝酸A的生物利用度相對(duì)較高，而水溶液提取物的相對(duì)生物利用度較低。由于溶媒極性的不同導(dǎo)致2種提取物中化學(xué)組分不同，從而各成分間的體內(nèi)相互作用影響靈芝酸A在大鼠體內(nèi)過(guò)程，使起生物利用度存在顯著差異，是否產(chǎn)生不同的藥效學(xué)需要進(jìn)一步考察。

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