崔雪萍，郭陽(yáng)陽(yáng)，史 琳，張 寧，韓 梅

賴(lài)氨酰氧化酶(LOX)是一種依賴(lài)銅的氨基氧化酶，在膠原和彈性蛋白由可溶性單體轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)建?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)腫瘤中LOX的表達(dá)改變使LOX可作為一個(gè)治療靶點(diǎn)[1-3]。β-氨基丙腈(BAPN) 是LOX的不可逆性的抑制劑，其抑制作用呈劑量依賴(lài)性[4]。本文用BAPN抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的LOX活性，觀(guān)察對(duì)其增殖、遷移和黏附功能的影響，為進(jìn)一步了解LOX在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料：SGC-7901來(lái)源于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；培養(yǎng)基RPMI-1640購(gòu)自Gibco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自武漢三立公司；胰蛋白酶購(gòu)自Amresco公司；MTT和 BAPN為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：SGC-7901復(fù)蘇后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 四唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)：分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞中加入含0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L和0.8 mmol/L BAPN的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，常規(guī)消化計(jì)數(shù)，取1.0×103個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入含上述濃度BAPN的培養(yǎng)液200 μl，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放入孵箱中培養(yǎng)。此后每天相同時(shí)間點(diǎn)取出，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μl，37 ℃孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清，每孔加150 μl DMSO，混勻振蕩10 min。在490 nm波長(zhǎng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度值，共檢測(cè)7 d。以時(shí)間為橫軸、光密度值(OD)為縱軸，繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。

1.2.3 同質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞分別用含0 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM BAPN的培養(yǎng)液預(yù)處理24 h，常規(guī)消化計(jì)數(shù)為105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，分別加入板底已長(zhǎng)滿(mǎn)SGC-7901細(xì)胞的24孔板中，每孔200 μl(即每孔中接種細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè))，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放入孵箱中培養(yǎng)60 min、90 min。吸出各孔上清液，生理鹽水洗滌數(shù)次，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)各孔上清液及洗滌液中的細(xì)胞數(shù)。同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)=2×104個(gè)-未黏附的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 異質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)：SGC-7901細(xì)胞分別用含0 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM BAPN的培養(yǎng)液預(yù)處理24 h，常規(guī)消化計(jì)數(shù)為105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，分別加入空的24孔板中，每孔200 μl(即每孔中接種細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè))，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸出各孔上清液，生理鹽水洗滌數(shù)次，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)各孔上清及洗滌液中的細(xì)胞數(shù)。異質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)=2×104個(gè)-未黏附的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 體外劃痕實(shí)驗(yàn)：分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞中加入含0 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM BAPN的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。消化后以2×106個(gè)/mL細(xì)胞分別接種至6孔板，每孔1 mL，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞匯合后用200 μl 的TIP槍頭劃痕，造成損傷模型，每孔加入2 mL含不同濃度BAPN的培養(yǎng)液。劃痕后即在倒置顯微鏡下攝像，記為0時(shí)，此后分別在8、24、32、48 h 攝像，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)算遷徙至損傷區(qū)的細(xì)胞數(shù)，以平均值評(píng)價(jià)SGC-7901在BAPN作用下的遷徙能力變化。

2 結(jié)果

2.1 BAPN抑制LOX對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響:MTT比色法檢測(cè)SGC-7901連續(xù)培養(yǎng)7 d的增殖情況。結(jié)果表明，加入0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM的BAPN，對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(P>0.05)；當(dāng)加入0.4 mM和0.8 mM的BAPN，可明顯抑制細(xì)胞的增殖(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 MTT法檢測(cè)不同濃度BAPN對(duì)MGC-7901細(xì)胞增殖的影響

2.2 BAPN對(duì)SGC-7901細(xì)胞同質(zhì)黏附能力的影響:培養(yǎng)60 min和90 min后，SGC-7901對(duì)相同細(xì)胞的黏附結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)BAPN濃度為0.1 mM培養(yǎng)60 min時(shí)，對(duì)SGC-7901細(xì)胞的同質(zhì)黏附無(wú)明顯影響(P>0.05)；但培養(yǎng)90 min時(shí)，細(xì)胞的同質(zhì)黏附能力增強(qiáng)(P<0.05)。當(dāng)BAPN濃度為0.2 mM和0.3 mM時(shí)，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)SGC-7901細(xì)胞同質(zhì)黏附能力均增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同濃度BAPN對(duì)SGC-7901同質(zhì)黏附能力的影響(×103個(gè)

2.3 BAPN對(duì)SGC-7901細(xì)胞異質(zhì)黏附能力的影響:SGC-7901經(jīng)不同濃度的BAPN作用3 h后，加入0.1 mM BAPN對(duì)SGC-7901細(xì)胞在24孔板上的異質(zhì)黏附能力無(wú)影響(F=286.405,P<0.05)；當(dāng)BAPN濃度為0.2 mM和0.3 mM時(shí)SGC-7901異質(zhì)黏附能力明顯減弱(F=286.405,P<0.05)。

2.4 BAPN對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響:與未加BAPN組相比，加入0.1 mM BAPN在24和32 h細(xì)胞遷移能力降低(P<0.05)；加入0.2 mM 和0.3 mM BAPN，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞遷移能力均降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同濃度BAPN對(duì)SGC-7901遷移能力的影響(個(gè)，

3 討論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，作用機(jī)制復(fù)雜，而腫瘤細(xì)胞的黏附能力在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤細(xì)胞需下調(diào)同質(zhì)黏附而脫落下來(lái)，繼而通過(guò)增強(qiáng)異質(zhì)黏附錨定于毛細(xì)血管壁上，并穿透管壁逸出血管進(jìn)入周?chē)M織，或侵入基質(zhì)，形成轉(zhuǎn)移。

目前，已有多項(xiàng)關(guān)于LOX與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究。LOX在腫瘤上皮細(xì)胞和被腫瘤侵襲器官的正常部分上皮細(xì)胞都是可以合成的，而且腫瘤上皮中高LOX水平和高格里森評(píng)分及腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移灶的診斷相關(guān)，正常上皮中高LOX水平與不良預(yù)后有相關(guān)性[6]。

大鼠前列腺癌細(xì)胞植入大鼠前列腺會(huì)導(dǎo)致LOX在腫瘤的表達(dá)增加且腫瘤有可能促進(jìn)臨近組織分泌LOX[7]。趙鵬等[8]發(fā)現(xiàn)，LOX在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中可能通過(guò)表達(dá)量增高促進(jìn)肺癌的發(fā)生和發(fā)展。在乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)LOX的過(guò)量表達(dá)能夠使得腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，特定通路被激活，MMPs類(lèi)表達(dá)水平上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移，新生血管出現(xiàn)，從而促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移[9]。Wilgus ML等[10]研究肺癌患者發(fā)現(xiàn)，有癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的患者比無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的LOX表達(dá)水平有明顯提高，認(rèn)為L(zhǎng)OX高表達(dá)可作為一個(gè)預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)。在乳腺癌、頭頸部鱗癌的發(fā)展進(jìn)程中，LOX促進(jìn)腫瘤的遷徙轉(zhuǎn)移[11]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中LOX表現(xiàn)出預(yù)測(cè)標(biāo)記的特性，并且在胰腺腫瘤小鼠模型中抑制LOX可以減少腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。而賴(lài)氨酰氧化酶樣蛋白4(LOXL4)可以促進(jìn)胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制LOXL4的表達(dá)可以抑制膀胱癌的腫瘤生長(zhǎng)。

為了研究LOX對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和黏附功能的影響，我們用BAPN抑制LOX活性，觀(guān)察胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、黏附能力的改變。首先通過(guò)MTT法檢測(cè)BAPN對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明當(dāng)BAPN在0.1～0.3 mM時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響，當(dāng)BAPN濃度高于0.4 mM時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)被明顯抑制。為了避免抑制細(xì)胞增殖而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇BAPN實(shí)驗(yàn)濃度為0.1～0.3 mM。

在同質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)中，加入高于0.2 mM的BAPN后，細(xì)胞的同質(zhì)黏附能力增加。異質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)中，濃度高于0.2 mM的BAPN可下調(diào)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)黏附。說(shuō)明BAPN抑制LOX后，SGC-7901細(xì)胞加強(qiáng)了與同種細(xì)胞的黏附，不易從腫瘤上脫落下來(lái)，與基質(zhì)和其他細(xì)胞組織的異質(zhì)黏附的能力也減弱，其轉(zhuǎn)移能力可能因此而下降。

本研究通過(guò)體外劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BAPN濃度增加至0.2 mM以上時(shí)，可抑制細(xì)胞的體外遷移能力。結(jié)果提示抑制LOX后，SGC-7901細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力相應(yīng)減弱，也不利于腫瘤轉(zhuǎn)移。

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