金華倩 丁文倩 儲(chǔ)利勝 李琳

浙江中醫(yī)藥大學(xué)浙江杭州310053

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是一類位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有自我更新和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞。成體神經(jīng)干細(xì)胞主要在側(cè)腦室下區(qū)（SVZ）和海馬齒狀回顆粒下區(qū)（SGZ）。缺血性腦損傷誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化。增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)干細(xì)胞移植可以促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)修復(fù)和功能恢復(fù)[1]。黃芪是常用的補(bǔ)氣中藥，能促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)再生[2]。黃芪總皂苷（TSA）是中藥黃芪的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、擴(kuò)張血管等作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)研究TSA對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：孕13～14天SD（Sprague-Dawley）大鼠，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥品：黃芪總皂苷，200mg（UV≥98%），購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：J20F7T9819。

1.3 主要試劑與儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶、青-鏈霉素溶液、PBS、Hanks緩沖液（杭州吉諾生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（美國(guó)Gemini公司），EGF、B27（美國(guó)Gibco公司），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）（美國(guó)PeproTech公司），細(xì)胞消化液Accutase、MTT、BrdU粉末、BrdU小鼠單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、DAPI（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠二抗（杭州達(dá)文生物有限公司），nestin小鼠單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司），倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.4 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和傳代：取孕13～14天的SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后，75%乙醇溶液浸泡消毒滅菌，取出胎鼠，將胎鼠置于4℃無(wú)菌Hanks溶液中，分離出胎鼠大腦全腦組織，剝除腦膜和血管，將腦組織切成小塊移至離心管內(nèi)，加入適量0.25%胰酶，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化15min后取出，膠頭滴管輕輕吹打混勻細(xì)胞至不見組織碎片，再加入10%FBS溶液終止消化，經(jīng)200目高壓滅菌的金屬篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液于1000rpm離心5min，棄上清液，加入適量的NSCs培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%B27+20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF+1%青-鏈霉素溶液），接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)的前3天每天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞聚集形成細(xì)胞球后2～3天半量換液。原代培養(yǎng)7天第1次傳代，以后5～7天傳代1次。細(xì)胞傳代操作：收集細(xì)胞液于離心管內(nèi)，1000rpm離心5min，棄上清液，加入1ml Accutase吹打數(shù)次致懸，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5min，室溫1000rpm離心5min，吸棄Accutase，加入1ml培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×106個(gè)/瓶接種到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定：取第3代神經(jīng)球和NSCs單細(xì)胞懸液，加入至經(jīng)多聚賴氨酸處理的24孔板中，每孔加0.5ml的細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱4h后取出，吸棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30min后，0.1%Triton X-100處理細(xì)胞15min，5%山羊血清37℃濕盒中孵育1h，加一抗體nestin（1∶100），4℃孵育一夜后，加入FITC標(biāo)記的二抗（1∶100）于37℃黑暗濕盒中孵育1h后，滴加DAPI，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性：取消化傳代的NSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/孔，接種于96孔板。加入不同濃度的TSA后分別孵育24、48、72h，共設(shè)8組（0、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10μg/ml TSA組），每組5個(gè)復(fù)孔，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h，96孔板離心后吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，置于搖床震蕩10min，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.7 BrdU/Nestin免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖：取消化傳代的NSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/孔，接種于有預(yù)先包被0.01%多聚賴氨酸的蓋玻片的24孔板內(nèi)培養(yǎng)，TSA（0、1、2μg/ml）同時(shí)加入BrdU（10 μmol/L）處理48h后，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定30min，0.25%Triton X-100破膜20min，加2mol/L的HCl室溫下變性30min，加入0.1mol/L的硼酸鈉（pH 8.5）中和反應(yīng)10min，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫下孵育20min，加羊血清工作液封閉于37℃1h，加一抗BrdU（1∶100）于4℃孵育過(guò)夜，次日加Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗（1∶100），于37℃避光孵育1h，再加羊血清工作液封閉于37℃孵育1h，加一抗nestin（1∶100）工作液4℃孵育過(guò)夜，次日加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗（1∶100），于37℃避光孵育1h，再滴加DAPI，于熒光顯微鏡下觀察。每組隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野下BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率/%=BrdU陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析（ANOVA）并SNK進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)：原代培養(yǎng)第2天鏡下可見部分細(xì)胞貼壁，部分細(xì)胞懸浮呈球狀，第3代細(xì)胞聚集呈細(xì)胞球，折光性好。見圖1。

圖1 NSCs形態(tài)

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定：免疫熒光結(jié)果顯示，神經(jīng)球表面基本完全呈nestin陽(yáng)性表達(dá)，單個(gè)NSCs近92%呈nestin陽(yáng)性表達(dá)。見圖2。

2.3 黃芪總皂苷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度TSA孵育NSCs 24、48、72h后，同一時(shí)間點(diǎn)，與0μg/ml TSA組比，1、2μg/ml TSA組的細(xì)胞存活率差異顯著（P＜0.05），其作用于48h效果最顯著（P＜0.01）。見圖3。

圖2 NSCs鑒定

圖3 不同濃度TSA作用不同時(shí)間對(duì)NSCs增殖的影響（n=5）

2.4 BrdU/Nestin免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖結(jié)果：BrdU/Nestin免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示1、2μg/ml TSA孵育NSCs 48h后，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比例均較對(duì)照組（0μg/ml TSA）顯著增多（P＜0.01）。見圖4。

圖4 TSA作用48h對(duì)NSCs增殖的影響（n=6）

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新能力，并能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。Nestin又名巢蛋白，是一種中間絲蛋白，主要在NSCs內(nèi)一過(guò)性表達(dá)，當(dāng)NSCs向終末細(xì)胞分化后，Nestin表達(dá)停止。所以巢蛋白常被用來(lái)標(biāo)記NSCs。我們采用Nestin標(biāo)記神經(jīng)球和單個(gè)NSCs，均證實(shí)我們培養(yǎng)的NSCs純度達(dá)到90%以上。

腦卒中能誘導(dǎo)NSCs增殖、遷移和分化，促進(jìn)損傷的腦組織修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。但在無(wú)任何干預(yù)的情況下，腦缺血后死亡的神經(jīng)元中僅有0.2%被新生神經(jīng)元替換，不足以改善缺損的神經(jīng)功能[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，藥物治療可以促進(jìn)腦缺血后NSCs增殖、遷移和分化。研究表明，一些中藥及其活性成分不僅可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，而且能促進(jìn)NSCs的增殖并誘導(dǎo)其定向分化為神經(jīng)元，達(dá)到治療神經(jīng)功能缺損疾病的目的[6]。中藥黃芪具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、改善腦血流等作用[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)黃芪能促進(jìn)腦缺血后NSCs增殖分化[8]。韋云飛等[9]研究也發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能促進(jìn)腦缺血后NSCs增殖和分化。黃芪皂苷是黃芪的主要有效成分之一，具有神經(jīng)保護(hù)和抗缺血性腦損傷作用[10-11]。本研究首先采用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TSA促進(jìn)NSCs增殖具有劑量和時(shí)間依賴性，其中1、2μg/ml TSA處理48h的作用最顯著，采用BrdU標(biāo)記NSCs進(jìn)一步證實(shí)TSA促進(jìn)NSCs增殖。

總之，黃芪總皂苷促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs增殖，但是否促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞增殖，以及促進(jìn)增殖的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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