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        PCR技術(shù)在豬肉中微生物檢測(cè)的應(yīng)用分析

        2018-01-17 05:47:48鞏長(zhǎng)海江蘇權(quán)正檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司
        食品安全導(dǎo)刊 2018年30期
        關(guān)鍵詞:雙鏈食源性金黃色

        □ 鞏長(zhǎng)海 江蘇權(quán)正檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司

        食品安全關(guān)系著人們的身體健康、社會(huì)經(jīng)濟(jì)的有序發(fā)展以及社會(huì)的和諧穩(wěn)定,保障食品安全是全社會(huì)、全人類的共同責(zé)任。食品安全中最主要面臨的問題為食源性疾病,即通過攝食進(jìn)入人體的有害物質(zhì)引發(fā)的一類疾病,包括食物中毒、腸道感染、寄生蟲病以及有害的化學(xué)物質(zhì)引發(fā)的疾病。

        我國(guó)每年消費(fèi)大量的豬肉,作為居民副食品,豬肉的消費(fèi)占肉類總消費(fèi)比重的50%以上。但最近幾年,關(guān)于豬肉安全問題的事件層出不窮,近十幾年來,豬肉安全問題事件高達(dá)700多起,50%以上的食品安全事件是由違規(guī)使用瘦肉精、二噁英等化學(xué)品引發(fā)的,還有一部分來源于物理性風(fēng)險(xiǎn)。全世界每年有70%的食源性疾病患者是由致病微生物引起的。因此,微生物是引發(fā)是源性疾病的根源,在豬肉進(jìn)入市場(chǎng)之前,就有必要對(duì)其進(jìn)行致病微生物檢測(cè),從而減少食品安全問題事件的發(fā)生。

        目前,檢測(cè)豬肉中微生物的主要技術(shù)有PCR技術(shù)、DNA探針法、基因芯片等。傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)存在檢測(cè)效率低而成本高的弊端,使用受到了限制。PCR技術(shù)因高特異性、高靈敏性和簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)成為其中一種最常用的檢測(cè)方法。

        1 PCR微生物檢測(cè)技術(shù)的原理

        PCR技術(shù)主要是由變性、退火、延伸3個(gè)熱循環(huán)步驟構(gòu)成,即在95℃高溫下,DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃詾閮蓷lDNA單鏈,在37~55 ℃的低溫下,兩條寡核苷酸引物與DNA單鏈結(jié)合,形成部分雙鏈,然后以單核苷酸為原料,沿DNA鏈從5’端向3’端延伸,合成DNA新鏈。這樣,每個(gè)雙鏈的DNA模板經(jīng)過變性、退火、延伸3個(gè)步驟的熱循環(huán)之后,形成了兩條雙鏈DNA分子,如此循環(huán)往復(fù)。

        2 PCR技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

        2.1 PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中的沙氏菌

        沙氏菌占美國(guó)食源性疾病的30%,沙氏菌病原體也是引發(fā)我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)食源性疾病的首要病菌。沙氏門菌主要存在于豬肉中,所以對(duì)豬肉中的沙氏菌進(jìn)行快速而有效的檢測(cè)可以有效防止沙氏菌引起的食物中毒。研究者王靜等人發(fā)現(xiàn),在脫氧膽酸鈉和疊氮溴化丙錠(PMA)的共同作用下,可以大幅度地抑制沙氏菌死菌DNA的PCR擴(kuò)增,活菌DNA的擴(kuò)增不受影響。把疊氮溴化丙錠(PMA)與微滴數(shù)字PCR技術(shù)相結(jié)合,可以針對(duì)性地對(duì)豬肉中的沙氏菌進(jìn)行有效檢測(cè)。

        2.2 PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中的大腸桿菌

        腸出血性大腸桿菌可以引發(fā)腸炎和出血性腹瀉,又被稱為大腸埃希氏菌。其中最主要的菌型是大腸桿菌,它是一種新型的腸道致病菌,是全世界公認(rèn)的人獸致病微生物,主要寄生在豬、牛、羊等動(dòng)物中。國(guó)內(nèi)研究者針對(duì)大腸桿菌的菌體抗原基因、鞭毛抗原基因、溶血素基因、緊密黏附素基因和和志賀祥毒素基因的序列,設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性的引物和探針,快速、特異性的檢測(cè)大腸桿菌。

        2.3 PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中金黃色葡萄球菌

        金黃色葡萄球菌可以引發(fā)動(dòng)物和人體的化膿感染,產(chǎn)生的腸毒素可以造成食物中毒,腸毒素具有極高的熱穩(wěn)定性,在幾百攝氏度的高溫下也不會(huì)失活,所以,即使感染的食物經(jīng)過高溫烹煮仍然存在致病的風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)過市場(chǎng)檢測(cè),生豬肉中金黃色葡萄球菌的檢出率接近20%,應(yīng)引起食品監(jiān)管部門的高度重視。國(guó)內(nèi)研究者李苗云等人把金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因作為靶基因,再與BP平板計(jì)數(shù)法相結(jié)合,在20℃條件下PCR熒光測(cè)定生豬肉中的金黃色葡萄球菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在穩(wěn)定期之后傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法低于熒光測(cè)定。

        2.4 PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中的單核李斯特菌

        李斯特菌是一種單核細(xì)胞增生菌,也是一種易引發(fā)人畜共患的食源性病菌。單核細(xì)胞增生菌具有嚴(yán)重的致病性,可以引發(fā)敗血癥、腦膜炎等。該病菌在5℃左右的低溫下仍然可以生長(zhǎng)和繁殖,所以大量存在于未殺菌的冷藏食品中。國(guó)內(nèi)研究者李丹丹用iap基因作為靶基因,合成引物和探針,用實(shí)時(shí)熒光定量的PCR快速檢測(cè)方法,靈敏度為6.5CFU/mL。國(guó)外研究者采用了RT-PCR法檢測(cè)低溫冷凍的豬肉中的單核李斯特菌,省掉了預(yù)富集的步驟,與其他幾十種菌株沒有擴(kuò)增信號(hào),而且特異性良好。

        3 結(jié)語(yǔ)

        目前,PCR技術(shù)在食源性致病微生物、轉(zhuǎn)基因成分以及動(dòng)物源成分檢測(cè)中得到了非常廣泛地應(yīng)用。該技術(shù)一旦被推廣使用,將會(huì)大大縮短檢測(cè)時(shí)間,提高檢測(cè)效率,食品檢測(cè)水平也隨之提高。但是,PCR技術(shù)也存在一定的缺陷:如果致病微生物發(fā)生高度變異,會(huì)使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性;用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品不同,結(jié)果沒有參考價(jià)值。PCR技術(shù)可以對(duì)豬肉中的微生物進(jìn)行定量檢測(cè),還可以應(yīng)用拓展到更多的食品安全領(lǐng)域。

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