敬 珮，管曉燕，王 倩，顧 瑜，胡 歡，肖琳琳，劉建國2，

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 正畸二組， 貴州 遵義 563099，；2.遵義醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 口腔內(nèi)科學(xué)教研室，貴州 遵義 563099，；3.貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室暨遵義市口腔疾病研究重點實驗室，貴州 遵義 563006)

地方性氟中毒，是一種環(huán)境化學(xué)性地方病，危害全身，主要侵犯人體的牙齒和骨骼，造成氟斑牙和氟骨癥， 分布地區(qū)廣，患病人數(shù)多且集中，是我國當(dāng)前危害最嚴重的地方病。氟中毒(fluorosis)大部分是由于生活中飲用水質(zhì)氟含量超標導(dǎo)致體內(nèi)氟積蓄過多侵害人體骨骼和牙齒，引起以氟斑牙、氟骨癥為主要特征的一種慢性全身性疾病，少部分人還可通過食物和空氣途徑引起該病。氟斑牙又稱氟牙癥(dental fluorosis)或斑釉牙(mottled enamel)，是人體牙在發(fā)育礦化時期攝入過量的氟，損害了處于釉質(zhì)礦化期的成釉細胞所引起的釉質(zhì)礦化不全，是氟中毒最早出現(xiàn)的、最直觀的特異性表現(xiàn)。造成氟斑牙的具體機制尚不明確， 有推測認為是由成釉細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)導(dǎo)致的細胞蛋白表達錯誤及細胞凋亡引起的[1]。研究表明在氟作用于成釉細胞的過程中，自噬水平也相應(yīng)上身，自噬是細胞在遭受外界刺激下自身啟動的保護機制，現(xiàn)就氟誘導(dǎo)成釉細胞自噬上調(diào)的機制綜述如下。

1 氟斑牙

氟斑牙在世界各地均有發(fā)生，而我國氟斑牙患病者最為普及，寧夏回族自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)、陜西、山西、甘肅、河北、山東、貴州和福建等地都有慢性氟中毒區(qū)，貴州更是氟斑牙大省。

牙齒的釉質(zhì)發(fā)育礦化過程復(fù)雜且每一步都緊密相聯(lián)。成釉細胞在早期合成和分泌牙釉質(zhì)基質(zhì)，而在后期則會對這些基質(zhì)重吸收和降解以完成牙齒的礦化，是牙釉質(zhì)形成最重要的細胞。釉質(zhì)基質(zhì)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被合成，在高爾基復(fù)合體中修飾加工，再通過Tome突內(nèi)的管網(wǎng)結(jié)構(gòu)分泌出去，分泌的釉質(zhì)基質(zhì)的量很大程度上影響將來發(fā)育完成的釉質(zhì)層的厚度。氟斑牙在形成初期蛋白分泌減少，釉質(zhì)基質(zhì)不足，后期蛋白水解酶分泌量不足，釉基質(zhì)蛋白含量過多，釉柱晶體的生長受到干擾，無法形成正常釉質(zhì)結(jié)構(gòu)及厚度，也不能正常礦化，最終形成了氟斑牙。

2 自噬

自噬是細胞在遭受饑餓、氧化應(yīng)激、毒性物質(zhì)等情況下，與溶酶體結(jié)合后降解自身受損的細胞器或表達錯誤的大分子蛋白物質(zhì)，再提供給細胞新蛋白質(zhì)及能量的過程，有循環(huán)再利用進行細胞的物質(zhì)更新、維護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和物質(zhì)回收再利用幫助細胞生存等功能。自噬被首次發(fā)現(xiàn)是1962年Ashford和Porten在肝細胞中觀察到，隨后在酵母中發(fā)現(xiàn)了自噬的分子機制，近年來，哺乳動物的自噬的相關(guān)基因及具體發(fā)生機制已經(jīng)日益清楚[2]，也了解到自噬在神經(jīng)退行性變、代謝性疾病、衰老及腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用[3]。自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)及分子伴侶介導(dǎo)性自噬(chaperon-mediated autophagy,CMA)。①巨自噬：是在細胞收到外界刺激后如饑餓、缺氧、素等，出現(xiàn)來源不明的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)，被稱為自噬泡，其膜不斷延伸包裹受損細胞器、錯誤蛋白質(zhì)或一些其他多余大分子物質(zhì)，最后逐漸封閉形成自噬小體，再通過微管運輸?shù)饺苊阁w，自噬體外層膜與溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體，之后內(nèi)膜被溶酶體溶解，其內(nèi)容物在溶酶體內(nèi)被降解。巨自噬相較于其他兩種自噬最為普遍，通常所說的自噬也就是巨自噬，對促進細胞存活、維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和更新物質(zhì)提供能量等起著非常重要的作用。②微自噬：又稱小自噬，當(dāng)細胞遇到饑餓時，溶酶體局部凹陷包裹微體、衰老蛋白質(zhì)等，然后與溶酶體膜分離，單獨形成自噬小體，被運送到溶酶體腔內(nèi)被溶解。微自噬在細胞內(nèi)發(fā)生很少，主要功能就是在細胞遭受饑餓時通過自噬清除多余的大分子、降解衰老蛋白，為細胞提供新的物質(zhì)和能量，維持細胞生命狀態(tài)。③分子伴侶介導(dǎo)性自噬：1998年，由Cuervo和Dice首次提出分子伴侶介導(dǎo)性自噬的概念[4]。不同于巨自噬與微自噬，分子伴侶介導(dǎo)性自噬是錯誤折疊的蛋白質(zhì)與分子伴侶結(jié)合，通過特異性識別溶酶體膜上的受體，使蛋白質(zhì)進入溶酶體內(nèi)進行降解。蛋白質(zhì)上的特定氨基酸序列與分子伴侶Hsc70特異性結(jié)合后，所形成的復(fù)合體與溶酶體上的受體Lamp2α(Lysosome-associated membrane protein 2α)結(jié)合，再由溶酶體內(nèi)的另外一種分子伴侶介導(dǎo)進入溶酶體腔內(nèi)完成物質(zhì)的降解。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬

細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、修飾、運輸?shù)闹匾獔鏊?同時還是鈣的儲存庫，在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)平衡及誘導(dǎo)細胞凋亡方面具有重要作用。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，蛋白質(zhì)被折疊并修飾成最終具有功能活性的蛋白質(zhì)，該類蛋白質(zhì)會被轉(zhuǎn)運到高爾基體，而沒有活性的蛋白質(zhì)則繼續(xù)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成折疊與修飾，或者進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑(ER-associated degradation,ERAD)，通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解[5]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)平衡被破壞時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能將發(fā)生紊亂,產(chǎn)生大量未折疊蛋白或錯誤蛋白并不能被有效降解，廢用物質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量的堆聚，并且產(chǎn)生鈣離子濃度異常，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

成釉細胞在過量氟化物刺激下產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]，蛋白分泌減少、釉質(zhì)基質(zhì)不足和釉質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。并且成熟期成釉細胞分泌多種蛋白水解酶，如果此時細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可導(dǎo)致酶蛋白合成錯誤，相關(guān)酶分泌量減少，釉基質(zhì)蛋白無法被水解而堆積，基質(zhì)含水量增多，釉柱晶體的生長受到干擾，無法形成正常釉質(zhì)結(jié)構(gòu)及厚度，不能正常礦化[1]。而自噬作為一個高度保守的保護性機制，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成錯誤蛋白潴留，細胞凋亡的時候，細胞上調(diào)自噬表達水平，啟動保護機制。從酵母細胞到哺乳動物，細胞中都存在自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的高度保守的相互調(diào)控[7]。Jacinto-Alema等[8]證明，過量的氟化鈉誘導(dǎo)成釉細胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。Sierant 等[9]研究表明，氟在誘導(dǎo)成釉細胞凋亡時都同時發(fā)現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的參與。雷雙等[10]研究顯示，當(dāng)對成釉細胞給予過量氟干預(yù)會造成細胞自噬水平上升。

3.1 未折疊蛋白反應(yīng)與自噬 細胞在出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,為緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài),在其發(fā)生的早期可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細胞核之間的信息傳遞通路,調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白的表達,減少錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白積聚,以恢復(fù)其功能和穩(wěn)態(tài),這一過程稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[1]。在UPR的三條未折疊蛋白反應(yīng)信號傳導(dǎo)通路均被證實在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時與細胞自噬存在相關(guān)性。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulaing protein 78,GRP78)又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白能夠及時反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤蛋白質(zhì)的堆積以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中分子的變化。在無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、肌醇需求酶1(inositol repuiring enzyme 1,IRE1)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)均分別與GRP78結(jié)合，無活性，當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，GRP78與PERK、ATF6、IRE1發(fā)生解離而與更具有親和力的未折疊蛋白質(zhì)結(jié)合，釋放UPR傳感器,激活UPR，允許UPR信號跨過ER 膜激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞質(zhì)和細胞核[11]，從而啟動對細胞的保護作用。GRP78對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)行使正常功能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬發(fā)生非常重要，抑制GRP78后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失去正常功能，雖然UPR、LC3仍然會被激活，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)的自噬體無法形成[12]。張凱強等[13]發(fā)現(xiàn)對大鼠成釉細胞給以不同濃度的氟化物時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子 GPR-78、XBP-1、caspase-12 等的表達量隨著氟化物濃度的升高而增高。

IRE1活化后，其激酶活性域通過促細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(ASK1)和分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 ,TRAF-2)，在TRAF-2的作用下激活c_Jun氨基末端激酶(JNK)途徑[14]，JNK迅速磷酸化Bcl2，使其與Beclin_1分離[15]，從而激活PI3K激酶途徑，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放與III型磷酸肌醇3激酶/泡膜蛋白34 ( PI3K/Vps34) 、Vps15 及 Atg14 組成 Beclin1 復(fù)合體促進自噬柄成核、延伸形成自噬體[16]，進而調(diào)節(jié)自噬下游。還有研究表明，IRE1可以通過增加X盒結(jié)合蛋白1基因(Xbp-1)的轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)自噬，在扇貝毒素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，IRE1-XBP1路徑提高BNIP3基因的轉(zhuǎn)錄，而BNIP3抑制RHEB的表達從而抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路，產(chǎn)生自噬上調(diào)[17]。Kaori Kubota等[18]用高劑量氟刺激小鼠成釉細胞系，發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、生長停滯和DNA損傷、誘導(dǎo)蛋白(GADD153/CHOP,GADD45α)、結(jié)合蛋白(BiP)、GRP78、非分泌形式的碳酸酐酶VI(CA-VI)及Xbp-1在暴露于38ppm氟化物之后都被顯著誘導(dǎo)，且還發(fā)現(xiàn)成釉細胞對大劑量氟化物的毒性作用是由敏感并且活化的IRE1引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)所致。

其次，PERK活化會通過eIF2α_ATF4_CHOP信號通路來調(diào)節(jié)自噬。首先活化的PERK酸化eIF2α，促進ATF4的表達升高，ATF4的升高使得CHOP增加了mTORC1抑制物TRB3的表達量，mTORC1被抑制從而上調(diào)自噬。PERK_eIF2α_ATF4通路還能上調(diào)ATG12，促進LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化，誘發(fā)細胞自噬。同時活化的PERK會阻斷NF_IkB的翻譯從而激活NF_IkB，進而調(diào)節(jié)自噬[19]。有研究表明，在丙肝病毒感染產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，ATF6通過連接DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物3鏈和LC3II基因點253-99基礎(chǔ)啟動子區(qū)，使LC3II蛋白表達量增加，以上調(diào)自噬[20]。

3.2 Ca2+與自噬 馬林等[21]報道,隨著干預(yù)成釉細胞氟含量濃度的增加，細胞內(nèi)Ca2+濃度也隨之增加。有研究證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度升高，會抑制mTOR通路，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生自噬。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，釋放腔內(nèi)的Ca2+到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外，以激活細胞內(nèi)自噬途徑中的一些激酶和蛋白酶信號[21-22]。通過使用RNA阻斷劑和抑制劑證實，Ca2+依賴的自噬發(fā)生時，可以通過激活鈣及鈣調(diào)蛋白依賴激酶-β(calmoldulin dependent kinase-β,CAMKK-β)介導(dǎo)的5’_磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP_activated protein kinase,AMPK)活化，進一步抑制mTOR，上調(diào)細胞自噬，有研究表明肝細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過AMPK_mTORC1通路誘發(fā)細胞自噬[23]。

死亡相關(guān)蛋白激酶和calpain蛋白酶這兩個鈣依賴酶在細胞內(nèi)的Ca2+濃度的增加會被激活，參與自噬反應(yīng)的調(diào)節(jié)[24]。calpain-4基因敲除的小鼠MEFs，即使用各種自噬相關(guān)因子刺激也無法形成自噬小體，細胞內(nèi)堆積蛋白質(zhì)也沒有被明顯的降解。人類的骨肉瘤細胞缺失calpain-4后，在細胞內(nèi)檢測到大量表達的LC3-I和LC3-II，但它們只是蓄積在核內(nèi)體小泡中，并不能被附著到細胞膜上或者已經(jīng)黏附的LC3不能夠成熟，以致不能激活自噬的發(fā)生。

4 展望

Min Wei等[25]證明了氟化物誘導(dǎo)MC3T3-E1細胞凋亡以及自噬，加入RAPA自噬誘導(dǎo)劑后，細胞凋亡率隨之下降，表明誘導(dǎo)的自噬可保護MC3T3-E1細胞抵抗氟誘導(dǎo)的細胞凋亡。細胞為適應(yīng)各種刺激壓力激活自噬為其主要保護途徑，大量的實驗研究表明，通過恢復(fù)自噬通量和抑制凋亡，許多毒物所致的腎損傷可以通過藥理學(xué)試劑如海藻糖、二甲雙胍和雷帕霉素及大黃素顯著緩解[26-29]。研究表明，鉛(II)促進在RPT細胞自噬體的形成，并且增強自噬體的形成可以抑制細胞凋亡，從而減輕鉛對RPT細胞的毒性傷害[30-32]；自噬能減弱缺血/再灌注損傷后的神經(jīng)元細胞損傷[33]和鎘誘導(dǎo)的近端小管損傷[29]，營養(yǎng)缺乏或生長因子不足誘導(dǎo)細胞中的自噬能通過抑制細胞凋亡幫助細胞存活等。自噬也保護細胞免受各種其他凋亡刺激[33]。

過量氟對成釉細胞的具體損害機制雖然還未十分明確，但目前認為主要跟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及Ca2+通道有關(guān)，產(chǎn)生一系列反應(yīng)導(dǎo)致釉質(zhì)礦化不全，誘導(dǎo)自噬水平上調(diào)，自噬有可能對成釉細胞產(chǎn)生一定的保護作用，但自噬的保護反應(yīng)的具體機制不明確，最終為何會產(chǎn)生氟斑牙，是否因為自噬表達水平無法代償長期的過量氟攝入產(chǎn)生的損害？尚需更多研究探究與證實，相信在不久的將來一定可以明確具體機制并找到防治氟中毒的有效方法。