□ 鄭 波 山東省安丘市疾病預(yù)防控制中心

目前，國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中微生物檢測方法（GB 4789—2016）屬于傳統(tǒng)的食品微生物檢測方法。該方法所需設(shè)備簡單、技術(shù)成熟、準(zhǔn)確性較高，但缺點(diǎn)也十分明顯，過程復(fù)雜、耗時(shí)、耗力、耗材、無法對微生物進(jìn)行快速檢測。近年來，新興起的分子技術(shù)站在RNA、DNA水平上將一些微生物檢測出來，其在食品微生物檢驗(yàn)方面的優(yōu)勢日漸凸顯，已成為一種重要的食品微生物檢測方法。

1 基因探針技術(shù)

核酸原位雜交和膜上印跡雜交是在食品微生物檢測中最常用的2種基因探針技術(shù)，其具有定位性強(qiáng)、檢測速度快、操作簡易、特異性好及靈敏度高等諸多特點(diǎn)。目前，食品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌等大多數(shù)微生物都可以通過特異性的基因探針檢測出來。

2 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)即聚合酶鏈反應(yīng)，出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，是一種能短時(shí)間內(nèi)體外快速擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增技術(shù)。因其具有產(chǎn)率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好及易自動化等特點(diǎn)，在食品微生物檢測方面應(yīng)用越來越廣泛。

2.1 常規(guī)PCR

早在20年前，科研人員就采用傳統(tǒng)的PCR檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對沙門氏菌的檢測[1]。目前，PCR技術(shù)能實(shí)現(xiàn)大多數(shù)食品微生物檢出率在99%以上。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是指通過對PCR反應(yīng)體系中加入的熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。因其具有操作簡便、準(zhǔn)確率高、可實(shí)時(shí)定量、特異性強(qiáng)、靈敏度高、交叉污染少及自動化程度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來在食品微生物檢測中應(yīng)用越來越多。

2.3 多重PCR

多重PCR具有同時(shí)對多個(gè)微生物基因進(jìn)行檢測的特點(diǎn)，在食品中多種微生物的同時(shí)檢測應(yīng)用十分廣泛。如金黃色葡萄球菌具有較多毒力基因，可采用多重PCR方法對金黃色葡萄球菌中多個(gè)毒力相關(guān)基因進(jìn)行同時(shí)檢測，可以檢出微生物，了解微生物含毒力相關(guān)基因的致病性的強(qiáng)弱和數(shù)量多少。

2.4 免疫PCR

免疫PCR，是在20世紀(jì)90年代初研發(fā)出來的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術(shù)手段，可以將抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性進(jìn)行有機(jī)融合，利用一段已知DNA分子對抗體進(jìn)行標(biāo)記作為探針，在抗原抗體復(fù)合物上PCR對這段DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增粘附、電泳定性，按照相關(guān)的特異性PCR產(chǎn)物的有無，來對待測抗原是否存在進(jìn)行判斷。

2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，即RT-PCR檢測技術(shù)，其工作原理是提取細(xì)胞中的RNA，將其作為模板獲取cDNA，之后有效擴(kuò)增PCR。反轉(zhuǎn)錄PCR方法不僅可以應(yīng)用于食品微生物RNA檢測，也用來檢測在生長或侵染過程中食品微生物特定基因的表達(dá)變化量。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片的概念來源于計(jì)算機(jī)芯片，通過將大量按檢測要求設(shè)計(jì)好的探針固化，能一次雜交、檢測出多種靶基因的微生物，具有高精確度、高精密度和高靈敏度分析、多參數(shù)同步分析、快速全自動分析等特點(diǎn)，這對于建立靈敏高效的食品檢測體系有著傳統(tǒng)方法無可替代的優(yōu)勢，成為目前鑒別食品微生物的最有效的手段之一。目前，我國已將此技術(shù)引入國家食品標(biāo)準(zhǔn)中，如《出口食品中致瀉大腸埃希氏菌檢測方法 基因芯片法》（SN/T 3152—2012）等。

4 免疫分析法

4.1 酶聯(lián)免疫分析法

目前，ELISA試劑盒是最成熟的技術(shù)，微生物檢測一般采用夾心模式，在獲得微生物特異性抗原抗體之后，就能開發(fā)出靈敏度高和特異性強(qiáng)的快速檢測ELSIA試劑盒。目前，進(jìn)口產(chǎn)品主要有美國Transia系列、荷蘭Biocheck酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒等，國產(chǎn)則是良潤生物公司等生產(chǎn)的ELISA檢測試劑盒，檢測品種主要包括食品中的志賀氏菌、沙門氏菌、單增李斯特、金黃色葡萄球菌等微生物。

4.2 膠體金檢測卡

該技術(shù)工作原理是以層析膜作為反應(yīng)載體，以膠體金作為顯色信號，將所需試劑都集成到檢測卡或檢測紙條上，加入待測樣品后20 min內(nèi)就能肉眼觀察檢測結(jié)果，因此非常適合現(xiàn)場快速檢測。目前，進(jìn)口產(chǎn)品主要是美國SDIXRapid Check系列，國產(chǎn)則是良潤生物公司生產(chǎn)的膠體金測試卡，檢測品種主要包括食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等微生物。

5 其他分子技術(shù)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，很的分子技術(shù)不斷被應(yīng)用于食品微生物檢測領(lǐng)域，如核糖體間隔區(qū)分析技術(shù)、核糖體RNA基因分析技術(shù)、基因重組法、生物傳感器技術(shù)、DNA指紋圖譜技術(shù)和功能性基因差異的DNA圖譜技術(shù)等。

傳統(tǒng)的微生物檢測方法已逐漸難以滿足現(xiàn)代社會對食品微生物快速精確檢測的需求，分子技術(shù)憑借操作簡便、靈敏高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)正逐漸成為微生物分類鑒定的主要手段，可使微生物的檢測逐步向靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性大、簡易經(jīng)濟(jì)的方向不斷發(fā)展。目前應(yīng)用于食品微生物鑒定方面的分子技術(shù)還相對有限，大多還處在實(shí)驗(yàn)室階段，大部分僅能作為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的參考。