吳皓 陶永

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科上海交通大學醫(yī)學院耳科學研究所上海市耳鼻疾病轉化醫(yī)學重點實驗室

伴隨著生物科學日新月異的發(fā)展，耳科學的基礎研究也有了長足的進步。電子顯微鏡技術的發(fā)展，生物學已經(jīng)在介觀、微觀領域取得諸多突破，聽覺研究也從毛細胞延伸到突觸及聽覺中樞；基因編輯技術的進步，內(nèi)耳的基因調(diào)控越來越精準、高效，耳聾模式動物的基因治療有了重大突破；單細胞圖譜理念的推廣也使聽覺發(fā)育的研究越來越精細化。近兩年耳科學主要研究進展梳理如下：

1 耳聾機制研究

后天性聾（噪音性、老年性、免疫性、藥物性等）的發(fā)病率日漸增高，其研究也越來越深入，尤其是后天性聾早期的突觸病變以及免疫性耳聾的研究取得了一定的進展。通過突觸退化及內(nèi)耳免疫在耳聾發(fā)病機制的研究，可以探索耳聾發(fā)生機制并研發(fā)聽力保護性治療方案。

1.1 突觸研究

噪音性聾和老年性聾在發(fā)病早期常無法檢測到聽閾的上移和螺旋神經(jīng)節(jié)的凋亡，但近年來的深入研究表明聽力下降早期即有突觸的退化，稱為“隱性聽力下降”。耳蝸突觸退化是造成“隱性聽力損失”的主要原因，是噪音性聾和老年性聾的早期病理改變之一，也是噪音背景下言語識別率低的主要原因。螺旋神經(jīng)節(jié)與毛細胞之間突觸的消失早于毛細胞的凋亡，突觸的缺失并不影響聽性腦干誘發(fā)電位(ABR)的閾值，只能通過高分辨率的共聚焦顯微鏡檢測。

噪音暴露后突觸廣泛的消失而不伴毛細胞明顯凋亡的現(xiàn)象廣泛存在于小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠和猴子。由于內(nèi)毛和外毛細胞的突觸前和突觸后表達的離子通道和輸入電阻的不同，內(nèi)毛和外毛的突觸敏感性有差異[1]。突觸的退化可能和谷氨酸興奮毒性有關，但具體機制尚不清楚，也缺乏有效的檢測方式。激光的瞬時光波損傷可破壞大鼠外毛細胞的纖毛，并導致ABR閾值上移，免疫組化結果表明突觸變少。這種單次高強度的刺激即可導致突觸病變，表明突觸損傷不需要谷氨酸長期刺激突觸后膜[2]。

接受噪音暴露后的豚鼠，其毛細胞的突觸退化后可有部分恢復，但是這可能只是突觸連接或受體蛋白的短暫改變所致，不一定是因為突觸再生[3]。小鼠的研究結果表明隱性聽力損失是可以被部分治療和預防的[4]。突觸退化的研究不但有助于探明聽力損失的病理機制，也為聽力保護的策略研究提供新思路，同時也有利于研發(fā)更為敏感的聽力檢測方法。

1.2 內(nèi)耳免疫

自身免疫性內(nèi)耳病是免疫相關的以膜迷路積水、螺旋神經(jīng)節(jié)變性、炎性滲出和毛細胞變性為主要表現(xiàn)的疾病。聽覺創(chuàng)傷后對耳蝸進行RNA測序、基因芯片檢測和實時定量PCR的研究發(fā)現(xiàn)，化學因子和細胞因子可以募集免疫細胞到耳蝸。目前已證實噪音損傷和耳毒性藥物可誘發(fā)TLR4(Toll like receptor 4)激活、促炎細胞因子和化學因子釋放等過程。有報道顯示毛細胞受損后CX3CR1+(Chemokine(C-X3-C motif)receptor 1)巨噬細胞調(diào)節(jié)CD45+細胞大量釋放[5]。

內(nèi)耳存在免疫自適應現(xiàn)象，內(nèi)耳細胞在免疫應答后表型不一的機制仍待研究。支持細胞和巨噬細胞參與了耳毒性過程，但是這些細胞如何感知耳毒性的發(fā)生？除了傳統(tǒng)的鈣離子信號通路，ROS和ATP信號通路也參與了耳毒性過程[6]。另外，CX3CL1/CX3CR1信號通路介導了毛細胞損傷后巨噬細胞對毛細胞的保護作用[7]。對能遷移進入耳蝸的免疫細胞類型的鑒定，并探明其參與內(nèi)耳免疫應答中分泌因子的過程、細胞中的相互作用，鑒定內(nèi)耳在損傷后免疫應答的損傷相關分子節(jié)律，可為耳毒性和噪音性聾相關藥物研發(fā)提供靶點[8]。

2 毛細胞發(fā)育及再生

哺乳動物內(nèi)耳毛細胞不可再生是內(nèi)耳發(fā)育研究及耳聾治療的瓶頸，近年來關于毛細胞發(fā)育的基因調(diào)控和毛細胞再生的探索取得了一定的成果。目前新生小鼠的毛細胞經(jīng)調(diào)控后可實現(xiàn)再生，然而成年動物耳蝸仍不能實現(xiàn)毛細胞再生，是毛細胞再生領域最大的桎梏。

2.1 毛細胞發(fā)育

隨著轉基因動物制備周期的縮短，利用基因調(diào)控來研究毛細胞發(fā)育越來越便捷。代表性研究包括在毛細胞轉分化之前敲除Six1(Sine oculis-related homeobox 1)基因可見毛細胞數(shù)目減少并伴感覺上皮的缺陷，表明轉分化過程中的Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2)的下調(diào)依賴于Six1，實驗表明Fgf8(Fibroblast growth factor 8)表達亦依賴于Six1[9]。Esrp1(Epithelial splicing regulatory protein 1)基因敲除小鼠可表現(xiàn)為耳蝸形態(tài)改變、毛細胞轉分化和細胞壽命變化，說明Esrp1基因是耳蝸發(fā)育的關鍵基因之一[10]。小鼠耳蝸條件性敲除Stat3(Signal transducer and activator of transcription 3)基因可以抑制毛細胞的轉分化，抑制Notch1信號通路可以促進STAT3的磷酸化[11]。Ick(Intestinal cell kinase)基因缺失可導致動纖毛IFT（Intraflagellar transport）異位表達，導致毛細胞極性的變化，從而影響聽力，證明了纖毛運動與毛細胞極性之間的相關性[12]。支持細胞敲除Connexin26和Connexin30可阻止內(nèi)毛細胞的成熟[13]。

2.2 毛細胞再生研究

Atoh1 是 basic helix-loop-helix(BHLH)家族轉錄因子，是毛細胞轉分化的關鍵基因。Atoh1在E12.5開始表達后誘導支持細胞向毛細胞轉分化，最近證實Sox2下調(diào)是Atoh1激活形成毛細胞的必要條件，可解釋雖然頂圈細胞更早退出有絲分裂期，但Atoh1的表達和轉分化從底圈開始[14]。

哺乳動物內(nèi)耳中具有類似干細胞性質(zhì)的聽覺祖細胞，通過分選不同部位Lgr5(Leucine rich repeat containing G protein coupled receptor)陽性和陰性的細胞后利用RNA-seq對細胞進行分析比對，發(fā)現(xiàn)了一系列與細胞增殖及轉化相關的分子特異性地在Lgr5陽性的祖細胞之中表達并與細胞的再生能力直接相關，針對這些分子進行調(diào)控極有可能增強毛細胞再生。轉分化的研究也有不少進展：Notch信號通路中的Hes/Hey轉錄因子可以通過結合Atoh1啟動子區(qū)域在發(fā)育過程中調(diào)控細胞命運[15]，通過調(diào)控多個細胞命運相關的基因p27,Atoh1,Pou4f3(POU domain,class 4,transcription factor 3)等實現(xiàn)了在成年動物中毛細胞的功能性再生[15]。表觀遺傳性在毛細胞再生中的作用取得了一定進展，包括組蛋白去甲基化酶LSD1通過與毛細胞發(fā)育及轉分化相關的H3K4調(diào)控甲基化修飾水平以及相關基因表達，為斑馬魚毛細胞再生所必需[16]。microRNA如mir-183、mir-210的發(fā)現(xiàn)亦為實現(xiàn)支持細胞到毛細胞的轉分化提供了新思路[17,18]。

除了調(diào)控支持細胞的基因?qū)崿F(xiàn)再生，研究人員也致力于在體外誘導分化出毛細胞，再使用細胞治療的方法將新的毛細胞植入內(nèi)耳完成再生。借助于近年來日趨成熟的類器官培養(yǎng)方法，誘導的人類多能干細胞可向聽覺細胞分化并最終獲得了具有電生理功能的毛細胞[19]。Lgr5陽性聽覺祖細胞的3D培養(yǎng)體系通過優(yōu)化條件實現(xiàn)了體外高效率的毛細胞誘導分化[20]。這些體外誘導技術能夠高度模擬生理條件下的內(nèi)耳中細胞復雜的調(diào)控系統(tǒng)。已有研究利用小鼠胚胎干細胞3D分化系統(tǒng)揭示了組蛋白抑制性蛋白復合物對于聽覺細胞發(fā)育重要因子Pax2(Paired box gene 2)的表觀遺傳調(diào)控機制[21]。

3 聽覺保護研究

得益于轉化醫(yī)學理念的深入，耳聾的研究逐漸從實驗室走向臨床，目前在歐美已經(jīng)有多項耳聾治療的臨床研究?；A研究-臨床實驗這一模式的成功，既為耳聾的治療提供更多手段，也極大推動了耳聾的基礎研究。

3.1 促進毛細胞再生的藥物

已有不少針對毛細胞再生從而改善聽力的臨床試驗正在開展。其中美國諾華制藥公司自2014年開始的利用腺病毒載體將Atoh1基因?qū)朊月穼崿F(xiàn)支持細胞到毛細胞轉分化的實驗，目前已處于二期臨床（ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02132130）階段。小分子藥物方面，應用Notch信號通路抑制劑LY356480治療感音神經(jīng)性耳聾也已在歐洲進入二期臨床（ISRCTN59733689）。美國Frequency Therapeutics的新型轉分化藥物FX-322的經(jīng)鼓膜注射方案在澳洲進入臨床一期研究(ACTRN12617000704392）。未來幾年可能有更多進入臨床的再生藥物。

3.2 保護性藥物

目前已知的保護聽力下降的臨床藥物實驗有：JNK激酶抑制劑（鼓室凝膠）、Atoh1轉錄因子（迷路注射）、D-蛋氨酸（口服）、N-乙酰半胱氨酸（口服/鼓室給藥）、硫代硫酸鈉（全身給藥）和依布硒啉（口服），均為I-II期臨床實驗。除了Atoh1調(diào)節(jié)毛細胞再生外，其他藥物皆是通過抑制氧化應激來減少噪音或耳毒性藥物對毛細胞的損傷。

4 耳聾治療研究

小鼠是研究內(nèi)耳基因治療常用動物模型，耳蝸中階、圓窗、卵圓窗是內(nèi)耳基因治療的傳統(tǒng)手術徑路。近年來利用經(jīng)典的病毒和熱門的CRISPR/Cas9，通過基因替代、基因沉默、基因編輯等方法在內(nèi)耳基因治療上均取得一定進展。

4.1 病毒載體

腺病毒在內(nèi)耳轉染的研究已有20多年歷史。腺病毒可以轉染內(nèi)耳細胞，但有一定的耳毒性[22]。不同血清型的腺相關病毒（AAV）可以轉染內(nèi)耳不同類型細胞，通過計算機技術研發(fā)合成的AAV2/Anc80L65可以高效轉染耳蝸毛細胞[23]。除了提高病毒本身的轉染效率，亦有研究證實Exosome可協(xié)助蛋白、核酸進入細胞，并可以提高AAV在內(nèi)耳的轉染效率[24]。

隨著病毒效率的提高，利用病毒載體成功治療遺傳性耳聾的報道有：AAV8-whirlin通過后半規(guī)管注射可以部分恢復Whirlin-/-小鼠的聽力和前庭功能[25]；Ush1c綜合征表現(xiàn)為先天性耳聾、前庭障礙和色素性視網(wǎng)膜炎，Ush1c突變小鼠不能正確翻譯harmonin蛋白，經(jīng)圓窗注射AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b可以恢復聽力和前庭功能[26]；AAV攜帶人工合成miRNA可以結合于Tmc1(Transmembrane channel-like gene family 1)突變基因，抑制突變基因的轉錄，從而抑制顯性遺傳導致的聽力下降[27]。

現(xiàn)階段基因治療僅限于小鼠新生階段干預，首要原因是缺少安全有效的手術徑路，最近證實成年小鼠后半規(guī)管注射可以轉染耳蝸細胞，為成年小鼠基因治療提供了技術支持[28]。

4.2 基因編輯

隨著CRISPR/Cas9基因編輯工具效率的提高，利用基因編輯工具在體治療遺傳性疾病成為可能。核糖核酸蛋白（RNP）介導的CRISPR/Cas9可在小鼠耳蝸毛細胞進行基因編輯并敲除Math1-GFP小鼠的GFP基因[29]。Tmc1點突變(c.T1235A)小鼠表現(xiàn)為遲發(fā)性耳聾，經(jīng)RNP介導的CRISPR/Cas9治療后聽力明顯恢復，毛細胞存活率明顯提升?；驕y序結果表明基因編輯脫靶率極低，證實了內(nèi)耳基因編輯的安全性[30]。首次證實了可通過基因編輯技術實現(xiàn)內(nèi)耳基因精準治療，為遺傳性耳聾的治療提供了新的途徑?；蚓庉嬛委煹膬?yōu)勢在于可精準靶向致病基因，而且徹底去除了遺傳性耳聾的病因。

4.3 干細胞移植

人的體細胞可在體外誘導成多能干細胞。目前可通過基因調(diào)控分化為有功能的毛細胞，提供了人類內(nèi)耳細胞的體外篩選平臺[19]。干細胞移植一直是耳聾治療的潛在方案，骨髓、脂肪和臍帶來源的間質(zhì)干細胞是可能的方案。隨著干細胞技術的發(fā)展，骨髓來源的間質(zhì)干細胞是最有可能用于內(nèi)耳細胞的替代治療方案[31]。

4.4 神經(jīng)營養(yǎng)因子

新生階段大鼠內(nèi)耳注射腺病毒介導的NT-3(Neurotrophin-3)可以加速大鼠聽力的發(fā)育，表明了NT-3可能參與了聽覺發(fā)育過程[32]。噪音暴露前在小鼠耳蝸圓窗注射NT-3可以促進突觸的再生[33]。噪音暴露前利用AAV在小鼠內(nèi)耳過表達NT-3，可明顯避免噪音導致的突觸丟失[34]。

5 前庭系統(tǒng)研究

前庭系統(tǒng)高通量轉錄組學和蛋白組學使毛細胞轉錄、纖毛發(fā)育、損傷后的細胞應答、非哺乳動物毛細胞再生的機制研究有了新的進展。而前庭細胞多態(tài)性的分子機制、脊柱動物前庭細胞成熟性/可塑性調(diào)控、前庭自發(fā)再生后的功能恢復以及前庭神經(jīng)元的再生仍是研究的難點[35]。

通過單細胞RNA-Seq已經(jīng)重現(xiàn)了新生小鼠橢圓囊毛細胞轉分化過程中的基因表達變化，可以進一步研究I型、II型前庭毛細胞及支持細胞等不同細胞亞型在發(fā)育階段的基因表達差異，從而建立相應的篩選文庫[35]。然而如何證實這些差異基因是必需的調(diào)控基因是研究的瓶頸。

通過胚胎干細胞誘導分化可以在體外培養(yǎng)出前庭感覺上皮細胞，并能檢測到有機械門控通道的I、II型前庭毛細胞[36]。

隨著體外3D器官培養(yǎng)技術和CRISPR/Cas9基因編輯技術的發(fā)展，前庭系統(tǒng)基因調(diào)控研究借助這些高通量研究技術可以很快推進。

6 耳科研究新技術

顯微鏡技術的發(fā)展和在體成像技術的提高，使得耳科學的研究可以在保持聽覺通路完整性的前提下開展，也可以在更微觀的層面探索聽覺機制。

6.1 雙光子技術

單光子共聚焦顯微鏡已經(jīng)在耳科學得到了廣泛應用，但僅限于觀察平面組織。雙光子成像具有高分辨率、高速、可穿透一定厚度組織的特點，可以非侵入地對在體組織進行觀察。通過熒光蛋白或熒光染料標記，或是結合光遺傳學，將細胞中的定位與表達技術相結合，可在生命體和細胞仍具有活性的狀態(tài)下對其功能進行動態(tài)觀察?？梢匝芯刻幱谏頎顟B(tài)的活體動物的神經(jīng)系統(tǒng)。雙光子技術已經(jīng)是神經(jīng)科學研究的重要工具，也逐漸在耳科研究中得到應用。將分離的小鼠耳蝸孵育于含鈣離子敏感的染料（Oregon Green BAPTA 488AM）培養(yǎng)基，在卵圓窗進行機械刺激模擬聲波振動基底膜，用雙光子成像系統(tǒng)記錄外毛細胞的鈣離子變化，從而實現(xiàn)保持耳蝸器官完整性的同時進行聽覺生理研究[37]。

6.2 活細胞成像

非侵襲性活細胞成像和標記技術為內(nèi)耳形態(tài)研究提供了時空動態(tài)、高清記錄的可能。Light-sheet顯微成像技術可以記錄長時間活體組織影像，并且多維度、長時程、高分辨率、光毒性小，為內(nèi)耳組織結構學研究提供新的可能[37]。

組織透明質(zhì)化和激光切割工具的出現(xiàn)，為基底膜的機械生物力學研究增添了新的工具[38]。

綜之，耳科學在近年來呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展的勢頭：研究的手段越來越多，研究的領域越來越廣，研究的程度越來越深，無論是基礎研究還是轉化研究都取得了可喜的成果。希望在國內(nèi)外耳科研究人員的共同努力下，共同推動學科的跨越式發(fā)展。

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