□ 黃 軒 銅川市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所

1 高效液相色譜-柱后衍生法的優(yōu)勢(shì)

目前，對(duì)黃曲霉毒素B1（AFB1）的檢測(cè)主要以《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》（GB5009.22-2016）的規(guī)定為主，有以下幾種：同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法與薄層色譜法等。在測(cè)定黃曲霉毒素過程中主要方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫修復(fù)篩選法、同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質(zhì)普法三種方法[1]。其中薄層色譜法相對(duì)復(fù)雜，試劑消耗相對(duì)較大，對(duì)于人們身體會(huì)產(chǎn)生極大的危害，方法專一性相對(duì)較差，屬于一種半定量方法。而相較于薄層色譜法來說，酶聯(lián)免疫修復(fù)篩查法步驟上相對(duì)簡(jiǎn)單，但所需要的抗體的壽命需要低溫保存，壽命非常短暫，保存難度非常高，同時(shí)檢測(cè)所得的結(jié)果上會(huì)出現(xiàn)較高的陽性率，在大量樣品的大范圍篩選中應(yīng)用較為廣泛，但無法實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的精準(zhǔn)定量。相較于以上兩種方法來說同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質(zhì)普法此種檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度相對(duì)較高，但設(shè)備昂貴、實(shí)驗(yàn)成本非常高，對(duì)于很多實(shí)驗(yàn)室來說并不具備使用此類方法的實(shí)驗(yàn)條件。

AFB1在不同條件之下會(huì)出現(xiàn)不同的反應(yīng)，在水溶液中會(huì)出現(xiàn)熒光淬滅，但在紫外線激發(fā)作用之下會(huì)出現(xiàn)熒光，可以通過三氟乙酸柱前衍生-HPLC法、碘或溴柱后衍生-HPLC法、光化學(xué)柱后衍生-HPLC法等三種衍生法來提升AFBI的熒光信號(hào)[2]。

光化學(xué)柱后衍生-HPLC法是采用光化學(xué)衍生器內(nèi)部是一定長(zhǎng)度的聚四氟乙烯管固定于254 nm紫外燈照射的不透光的反應(yīng)池架里，當(dāng)AFB1流過時(shí)，受到紫外光的照射后使AFB1的熒光性增強(qiáng)，從而提高檢測(cè)靈密度。因此光化學(xué)柱后衍生-HPLC法在使用了光化學(xué)衍生器后不需要其他化學(xué)試劑，只是連接到色譜柱和檢測(cè)器之間，其操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈密度高。

2 黃曲霉毒素B1檢測(cè)的材料和方法

2.1 儀器和試劑

島津LC-20AT高效液相色譜儀、RF-20A熒光檢測(cè)器、Milli-Q型純水機(jī)、月旭光化學(xué)衍生器、AFB1標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇色譜純等。

2.2 檢測(cè)樣品前處理

首先將樣品玉米研磨粉碎，顆粒控制在2 mm左右，稱取5 g樣品于50 mL的離心管中，加入1 g氯化鈉，再加入70%的甲醇溶液離心管液面到25 mL；蓋上瓶蓋輕微震蕩讓其混均勻，再將溶液在均質(zhì)器提取大約2分鐘，將溶液玻璃纖維慮紙過濾，吸取液3 mL加6 mL超純水再經(jīng)玻璃纖維慮紙過濾，吸取3 mL過濾液以不大于2 mL/min流速通過免疫親和柱，以10 mL超純水淋洗后吹干去除水分，準(zhǔn)確加入1 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并準(zhǔn)備上機(jī)。

2.3 色譜條件

色譜柱：月旭C18柱（4.6×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：甲醇∶水=45∶5。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品1 mg/L 1 mL一瓶，用甲醇溶液定容10 mL容量瓶把它稀釋 成 2.5、5、10、20、40 ng/mL的系列AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)室

取樣品加入10 ng/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法的線性范圍及檢出限用

分別檢測(cè)2.5、5、10、20、40 ng/mL的系列AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測(cè)AFB1標(biāo)準(zhǔn)的濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明AFB1在2.5～40 ng/mL范圍內(nèi)，峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為Y=aX+b，相關(guān)系數(shù)為R為0.999 2。

3.2 加標(biāo)回收利率

樣品加入10 ng/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL，進(jìn)行樣品前處理上機(jī)，樣品檢測(cè)結(jié)果9.75 ng/mL, 回收率為97.5%。

4 結(jié)論

光化學(xué)柱后衍生-HPLC法相比其樣品前處理簡(jiǎn)單、儀器成本較低、專一性高、靈密度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢(shì)。食品安全在現(xiàn)如今人們的日常生活中所受到的關(guān)注程度越來越高，而食品中的黃曲霉素B1其危害性非常高，所以在食品檢測(cè)過程中針對(duì)黃曲霉素B1的檢測(cè)方法也在不斷進(jìn)行改善，發(fā)揮出了非常顯著的作用。今后隨著時(shí)代的發(fā)展，食品中黃曲霉素的檢測(cè)方法還會(huì)不斷進(jìn)步。