， ，，， ，

細胞經(jīng)自噬途徑選擇性降解損傷或多余的線粒體的過程即為線粒體自噬。線粒體自噬對于線粒體的質量控制至關重要，并且參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程，其中包括缺血性腦損傷，即腦缺血。越來越多的證據(jù)表明線粒體自噬在不同的腦缺血病理過程中扮演了重要的角色。近年來，線粒體自噬被認為具有神經(jīng)保護作用，且調控線粒體自噬對細胞存活非常重要。因此，國內外越來越多的研究關注線粒體自噬的過程和其具體調控機制。本研究旨在對蛋白激酶Cε(PKCε)-煙酰胺磷酸核糖轉移酶(Nampt)通路的作用機制進行闡述，并總結其調控線粒體自噬的可能機制和在腦缺血中扮演的角色，為腦缺血的線粒體靶向治療提供新思路。

1 蛋白激酶C(PKC)和PKCε-Nampt通路

PKC是一種參與信號傳導通路非常重要的蛋白激酶，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，PKC通過使底物蛋白分子內絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化而發(fā)揮生物學功能[1-2]。細胞內大部分生命過程，如物質轉運、代謝、生長、發(fā)育、凋亡、各種應激事件及神經(jīng)活動的發(fā)生都涉及蛋白激酶磷酸化，并且蛋白激酶磷酸化也是多種信號轉導途徑中及其重要的環(huán)節(jié)。PKC不僅能使底物蛋白分子內的絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，而且還能夠影響基因的表達調節(jié)和細胞增生等，其在機體作用很廣泛[2]。經(jīng)典型的PKC(cPKC)包括α、βⅠ、βⅡ、γ四種亞型；新奇型的PKC(nPKC)包括δ、θ、η、ε四種亞型；非經(jīng)典型的PKC(aPKC)包括λ、ξ。其中PKCε在腦組織內含量十分豐富。PKC可影響神經(jīng)細胞的生存，影響神經(jīng)功能恢復，與神經(jīng)細胞的凋亡及壞死密切相關。因此PKC與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制密切相關。

目前國外對于PKCε-Nampt通路通過調控線粒體自噬從而保護缺血缺氧的神經(jīng)元的研究正處于上升期[3]。其保護神經(jīng)元的具體機制及其在預防和治療腦缺血疾病方面的潛在臨床價值仍有待研究[4]。PKCε是PKC家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶同種型，能夠賦予大規(guī)模線粒體保護，從而誘導神經(jīng)保護，同時是其他致命性缺血性損傷的重要信號通路。Nampt是參與氧化型輔酶Ⅰ(NAD)生產的酶，能夠維持線粒體功能和賦予缺血性應激后的神經(jīng)保護。腦缺血后的異常能量代謝誘導線粒體損傷，例如減少呼吸、自由基產生和促凋亡因子的釋放[1，5]。保持線粒體健康的機制，增強缺血性損傷后的神經(jīng)元活力，是產生缺血耐受的關鍵[6]。

2 PKCε與AMP激活蛋白激酶(AMPK)的調控關系

PKCε活性影響許多與缺血性神經(jīng)保護相關的線粒體過程的下游信號傳導途徑。研究發(fā)現(xiàn)，皮質PKCε可以調節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節(jié)激酶(MAPK)途徑和AMPK，表明PKCε能夠，調節(jié)線粒體生理學的酶調節(jié)轉錄因子和基因表達[7-9]，PKCε還可以直接調節(jié)線粒體功能。在海馬的研究表明PKC可易位到線粒體，從而磷酸化線粒體K+-ATP通道[10-11]，增加線粒體呼吸，減少線粒體氧化應激活性氧(ROS)產生，并抑制細胞色素C釋放[12-13]共同發(fā)揮作用保護線粒體對缺血的損傷。

Morris-Blanco等[5]在體外實驗中將神經(jīng)元膠質皮層培養(yǎng)物暴露在ΨεRACK(Tat-結合的PKCε活化劑)(100 nmol/L)1 h后，分析神經(jīng)元膠質皮層培養(yǎng)物中的全細胞裂解物，其顯示磷酸化AMPKThr172(AMPK的活化形式)水平顯著增加，同時還評估了乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化(是AMPK的直接下游靶標)。ACCSer79磷酸化在ψεRACK處理后也顯著增加。同時為了確定PKCε是否在體內激活AMPK，Morris-Blanco 等[5]在將大鼠經(jīng)ψεRACK腹膜內注射(0.5 mg / kg)后1 h從皮質中收集全細胞裂解物，這也導致磷酸化-AMPKThr172和磷酸-ACCSer79的顯著增加，表明PKCε足以激活AMPK，PKCε是缺血或白藜蘆醇預處理期間AMPK激活所需的關鍵信號通路。這些研究充分證明AMPK是PKCε調控的下游。

3 PKCε與AMPK共同參與調控Nampt，以PKCε為主

Neumann 等[14]研究發(fā)現(xiàn)缺血預處理在48 h后誘導Nampt水平增加(1.7±0.2)倍，但通過添加PKCε抑制劑ζV1-2可阻斷該效應。同時在IPC期間暴露于AMPK抑制劑對線粒體Nampt水平?jīng)]有影響。表明PKCε是缺血預處理后增加線粒體Nampt必不可少的因素。AMPK通過其與p53的相互作用促進凋亡性細胞死亡；AMPK還通過調節(jié)各種轉錄因子和配體調節(jié)劑[PGC1alpha、FOXO3a和sirtuin 1(SIRT1)]誘導線粒體產生，增強線粒體活性氧清除劑的表達，并增加線粒體呼吸，從而保護神經(jīng)元細胞[15]。AMPK可以增強Nampt的表達，Nampt是NAD主要生物合成途徑中的限速酶。盡管AMPK參與增強Nampt mRNA表達[16-17]，但目前還沒有研究調查了AMPK調節(jié)Nampt的線粒體特異性庫。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈在維持線粒體膜電位和產生三磷酸腺苷(ATP)中所必需輔酶[1，18]。在腦中，氧化應激或缺血事件后NAD的減少引起線粒體去極化，減少呼吸，產生凋亡信號和神經(jīng)元死亡。相反，研究證實細胞NAD的增加能預防腦缺血后線粒體功能障礙和神經(jīng)變性[5，10]。缺血事件期間NAD的減少引起DNA損傷，能量耗竭并導致神經(jīng)變性。Nampt過表達產生NAD來預防局部缺血后的線粒體功能障礙和神經(jīng)元死亡[10，19]。在氧化應激后特異性增強線粒體定位的NAD能夠保持線粒體膜電位，增強呼吸并防止凋亡誘導因子在大腦中的釋放。Nampt對神經(jīng)退行性損傷的保護作用最近已成為激烈研究的焦點。PKCε調節(jié)線粒體Nampt增加與NAD + / NADH比率的增加相關。NAD + / NADH比率的增加與NAD+依賴SIRT的活性相關。PKCε也可通過增加線粒體中的NAD + / NADH比率來調節(jié)線粒體SIRT活性。在缺血期間，PARP(DNA修復酶)的過度激活介導NAD +消耗和凋亡信號傳導。PKCε介導的線粒體NAD+可用性的增加可能有助于穩(wěn)定線粒體PARP的活性，維持NAD+庫，從而維持線粒體DNA完整性和預防細胞死亡[6，20]。在缺血或氧化應激期間通過線粒體NAD的保存可以維持電子傳輸鏈的活性，增強SIRT活性和防止PARP介導的NAD+耗盡來增強神經(jīng)元活力。

4 PKCε-Nampt通路通過調控線粒體脫硫酶基因提供缺血性神經(jīng)保護

PKC家族已經(jīng)連接到sirtuins[21-22]，是NAD +依賴性賴氨酸脫酰酶，與缺血和線粒體神經(jīng)保護相關。sirtuins的主要調節(jié)劑是Nampt，其通過增加NAD +水平增強sirtuin活性[23-24]。Nampt在預防腦缺血后的神經(jīng)變性中至關重要，因為遺傳研究顯示當Nampt被敲除時損傷加重[25-26]。Nampt過表達激活SIRT減弱缺血性損傷，表明Nampt-沉默調節(jié)蛋白通路可能對缺血性保護具有重要作用。哺乳動物沉默調節(jié)蛋白家族由七種同工型(SIRT1-7)組成，它們的蛋白質靶點，亞細胞定位和酶活性不同。雖然研究證實核或細胞質sirtuins與腦中的缺血保護相關[27-29]，sirtuins在IPC保護免受缺血性應激的能力中起著不可或缺的作用，但是研究重點一直在于SIRT1的核或細胞質活性。SIRT3-5是公認的線粒體沉默調節(jié)蛋白，其各自顯示獨特的酶翻譯后修飾[30]。例如，SIRT3是賴氨酸脫乙酰酶，SIRT4是賴氨酸ADP-核糖基酶，SIRT5是賴氨酸脫琥珀酰酶[2，19，31]。SIRT3和SIRT5定位于線粒體，分別被鑒定為線粒體賴氨酸脫乙?；唾嚢彼崦撶牾；闹饕{節(jié)劑[24，31]。蛋白質組學分析表明，約三分之一的線粒體蛋白含有賴氨酸乙?；蛸嚢彼徵牾；稽c[24，31]，這表明SIRT3和SIRT5可能對線粒體功能具有廣泛的影響。

Nampt是sirtuin活性的有效活化劑，因為sirtuin需要NAD +作為輔因子以驅動其活性。Morris-Blanco等[5]研究表明腦缺血后48 h，SIRT5脫琥珀酰酶活性在大鼠神經(jīng)元-星形膠質細胞培養(yǎng)物的線粒體中增加。通過在腦缺血期間暴露大鼠神經(jīng)元-星形膠質細胞于PKCε抑制劑εV1-2至線粒體，SIRT5活性的這種增加被消除。與SIRT5活性結果相反，ΨεRACK處理對線粒體SIRT3脫乙酰酶活性沒有影響。在ΨεRACK處理后48 h沒有觀察到線粒體蛋白或SIRT3的賴氨酸乙?；癄顟B(tài)的總體變化。這些數(shù)據(jù)表明PKCε和線粒體Nampt是SIRT5去琥珀酰酶活性的主要調節(jié)劑；PKCε-Nampt通路增強神經(jīng)保護和皮質線粒體SIRT5表達；SIRT5參與調節(jié)線粒體生物能量代謝、呼吸和腦缺血的神經(jīng)保護。

SIRT5阻止細胞死亡的確切機制目前還不清楚，但可能包括多種機制。例如，在腦缺血后，BAX轉移到線粒體，其中它結合到ATP/ADP轉位酶以形成涉及觸發(fā)細胞色素C的釋放和caspase介導的凋亡信號級聯(lián)的線粒體通透性轉換孔[21]。 PKCε通過防止凋亡信號傳導[9]為缺血后的心肌細胞提供保護。SIRT5與心肌細胞培養(yǎng)中的Bcl-xL(一種結合BAX的蛋白)的水平相互作用并調節(jié)其水平。此外，在氧化應激后，SIRT5的敲低增加胱天蛋白酶活性。SIRT5也可以與細胞色素C[32-33]相互作用，但是這種相互作用的功能結果目前還不清楚。該證據(jù)表明，在PKCε活化后，SIRT5介導的針對細胞死亡的保護可以包括參與細胞凋亡的幾種蛋白質和酶。

5 PKCε-AMPK-Nampt-SIRT5協(xié)同調節(jié)神經(jīng)元中的線粒體功能

PKCε在對腦缺血的保護中具有確定的作用。在缺血損傷之前，期間或之后使用PKCε的藥理學活化劑能有效防止皮質和海馬中的神經(jīng)變性[32]。 PKCε已被證明可對由腦缺血引發(fā)的缺血缺氧[9，33]提供強大的神經(jīng)保護；同時PKCε對于由白藜蘆醇和轉錄激活劑AMPK提供的缺血性神經(jīng)保護也可能是必需的。研究發(fā)現(xiàn)PKCε在腦缺血期間能夠預防興奮性毒性信號傳導和減少微血管血流量[34]。 PKCε進一步通過調節(jié)轉錄因子和基因表達以及直接磷酸化線粒體蛋白質來提供線粒體保護，以增加ATP產生，降低活性氧簇產生，維持線粒體膜電位和減少線粒體腫脹[8-9，35]。PKCε激活AMPK，增加Nampt線粒體池，從而增強NAD +水平，提供線粒體保護，減輕腦組織缺血損傷。Nampt是PKCε介導的缺血保護和調節(jié)SIRT5活性所必需的。這種保護途徑最可能發(fā)生在神經(jīng)元中，因為Nampt主要在神經(jīng)元中表達[25-26]，SIRT5在神經(jīng)元中相對于神經(jīng)膠質細胞更強烈地表達[29，36]。

目前的研究表明，PKCε-Nampt通路選擇性增強SIRT5活性，而SIRT3活性保持不變。因此，PKCε可能提高SIRT5蛋白的穩(wěn)定性。然而使用Nampt抑制劑在分離的線粒體上的實驗揭示，SIRT5去琥珀酰酶活性的增加與增加的NAD+可用性直接相關?；谶@一證據(jù)，Nampt和NAD +的產生似乎是SIRT5活性增加的驅動因素。SIRT5和Nampt水平在PKCε激活后的線粒體中增加的事實表明，這些酶可以充分協(xié)同調節(jié)對線粒體功能的影響。

6 總結與展望

PKCε在缺血誘導后被激活，能夠增強轉錄激活因子AMPK的活性，進而上調Nampt的表達，導致線粒體Nampt增加，Nampt水平上調增強NAD +水平，進而誘導并增加SIRT5的賴氨酸脫琥珀酰酶活性。SIRT5去琥珀酸化線粒體中的多個未知靶點，導致線粒體復合體活性的維持和對缺血損傷的保護。

盡管PKCε已經(jīng)在腦缺血中廣泛研究，但是在實驗性卒中模型中PKCε的作用機制研究缺乏。Bright等[37]研究顯示線粒體選擇性PKCε激活劑在缺血再灌注損傷后24 h改善神經(jīng)學評分，這表明線粒體PKCε激活可為腦缺血提供更好的治療作用。腦缺血后的許多異常細胞聚集在線粒體上，導致能量代謝失敗，氧化應激和凋亡信號傳導[5]。在已往的研究中，PKCε-Nampt通路已被確定為參與缺血性損傷后穩(wěn)定線粒體的主要參與者[33，38-39]。作為線粒體琥珀酰化的廣泛調節(jié)劑，SIRT5可以通過調節(jié)許多線粒體蛋白和酶以提供保護[40-41]，繼而保持線粒體生物能量運轉和保護大腦中的代謝應激和缺血性損傷。目前，抗缺血性腦卒中的中藥有效成分，多對線粒體自噬具有一定調控作用。進一步研究SIRT5如何被優(yōu)先激活及其介導線粒體保護的作用機制以及PKCε-Nampt通路調控線粒體自噬保護缺血神經(jīng)元的其他可能機制，可以幫助確定中藥調控PKCε-Nampt通路、線粒體自噬的靶點，為腦缺血的線粒體靶向治療提供新思路。