馮 蕾，呂興茹，劉 偉，王 原 （河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊05007）

0 引言

乳腺癌有發(fā)病率高、增速快、發(fā)病年齡低、治療率低等特點(diǎn)。研究［1］表明，二甲雙胍具有抗腫瘤活性，并可以提高癌癥患者（結(jié)腸、乳腺、胰腺、前列腺癌）的存活率。目前認(rèn)為二甲雙胍潛在的抗腫瘤機(jī)制包括直接和間接兩種方式。直接作用包括激活A(yù)MPK?mTOR途徑，抑制癌細(xì)胞增殖；調(diào)節(jié)microRNAs，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老；誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯等。間接作用為降低循環(huán)胰島素水平，導(dǎo)致胰島素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路減弱，緩解胰島素在腫瘤細(xì)胞中促進(jìn)有絲分裂和抗凋亡的作用。而最近發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)腫瘤耐藥性和乳腺癌干細(xì)胞的抑制作用又使其成為焦點(diǎn)，本文將對(duì)這些機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)進(jìn)行闡述。

1 糖尿病與乳腺癌的關(guān)聯(lián)

眾多研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病尤其是2型糖尿病是影響乳腺癌發(fā)病的因素之一。據(jù)報(bào)道，有18%的乳腺癌患者都合并患有糖尿病。患糖尿病的女性與沒有糖尿病的女性相比，前者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加15%～20%［2］。 同時(shí)研究［3］也發(fā)現(xiàn)，合并有糖尿病患者的腫瘤體積更大、惡性程度更高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與浸潤的幾率更高?；加刑悄虿〉娜橄侔┗颊弑葻o糖尿病乳腺癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)高出兩倍［4］，而二甲雙胍的使用能夠降低2型糖尿病患者癌癥的發(fā)病率［5］。在原發(fā)性HER?2陽性和激素受體陽性乳腺癌患者中，二甲雙胍可改善與糖尿病、胰島素治療相關(guān)的預(yù)后不良［6］。 最新研究［7］表明，二甲雙胍可以在 T?DM1（ado?trastuzumab emtansine）治療乳腺癌前應(yīng)用，臨床上用T?DM1治療此前已接受曲妥珠單抗和紫杉醇類藥物單獨(dú)或聯(lián)合治療的HER?2陽性、轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。二甲雙胍通過增強(qiáng)微囊蛋白1（caveolin?1）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來提高 T?DM1治療HER?2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床療效。

2型糖尿病與乳腺癌發(fā)生之間呈正相關(guān)，但乳腺癌與妊娠期糖尿病的關(guān)系尚未明確。Sister研究發(fā)現(xiàn)，多次妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）女性患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)可能升高［8］。該項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究旨在分析乳腺癌的環(huán)境和遺傳危險(xiǎn)因素，共納入50 884名35～70歲女性。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析發(fā)現(xiàn)，既往GDM與乳腺癌總體發(fā)病無關(guān)，但提示既往GDM和雌激素受體（estrogen receptor，ER）陰性乳腺癌間存在關(guān)聯(lián)。多次GDM（≥2次）可增加患浸潤性乳腺癌、ER?陽性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)及整體乳腺癌的發(fā)病率。研究［9］提示“胰島素生長因子生物活性增加可能具有促有絲分裂和抗凋亡作用，可影響乳腺組織在妊娠晚期的重構(gòu)，并促進(jìn)乳腺癌的發(fā)病和進(jìn)展。所以該研究建議：多次GDM的女性應(yīng)縮短乳腺癌篩查的周期。

一項(xiàng)最近的meta分析［10］表明糖尿病增加了婦女患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。這種關(guān)聯(lián)在2型糖尿病患者中得到證實(shí)，并支持糖尿病是乳腺癌獨(dú)立危險(xiǎn)因素的假設(shè)。但尚沒有足夠的研究來計(jì)算乳腺癌與1型糖尿病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。

2 通過抑制mTOR通路抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其凋亡

已有研究［11］表明，在乳腺癌中 mTOR（mammali?an target of rapamycin）信號(hào)的過度激活與腫瘤的侵襲性生長有關(guān)，而且mTOR途徑不僅與乳腺癌的腫瘤發(fā)生相關(guān)，還涉及乳腺癌對(duì)化療和激素治療的敏感性。目前二甲雙胍對(duì)mTOR的抑制是直接作用還是間接作用尚未明確。一項(xiàng)研究［12］顯示，二甲雙胍能促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）的表達(dá)，抑制上游的mTOR活性，同時(shí)還能抑制其下游的PS076，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0?G1期。這說明二甲雙胍在一定程度上具有間接抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。另有實(shí)驗(yàn)［13］也證明二甲雙胍可以直接抑制mTOR信號(hào)，激活A(yù)MPK。最近有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可能通過啟動(dòng)聚集體形成促使 mTOR降解［14］，二甲雙胍誘導(dǎo)mTOR蛋白聚集在核周區(qū)域形成聚集體，細(xì)胞中積累的蛋白質(zhì)通常被運(yùn)送到微管組織中心，在那里它們被隔離成單個(gè)大的核周聚集體［15］，而后促進(jìn)它們通過降解而被清除。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍降低了MCF?7乳腺癌細(xì)胞中總mTOR蛋白的水平，并且總mTOR蛋白水平的降低與MCF?7乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力的降低正相關(guān)。該研究還提出，mTOR蛋白在乳腺癌細(xì)胞中降解速度減慢可能為mTOR蛋白在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平較高的潛在原因，而mTOR蛋白在非癌性細(xì)胞中更快地降解，由此產(chǎn)生的差別也許可以為開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供新思路。該研究也為二甲雙胍抑制AMPK?mTOR信號(hào)通路提供了證據(jù)，并且他們認(rèn)為二甲雙胍引導(dǎo)mTOR降解在抑制癌細(xì)胞生長過程中發(fā)揮了重要作用。

3 二甲雙胍通過調(diào)節(jié)胰島素水平間接對(duì)乳腺癌細(xì)胞起作用

已有研究［16］表明胰島素在多種腫瘤中具有促有絲分裂的和抗凋亡的作用，這其中包括乳腺癌，而且胰島素還可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子增加腫瘤的供血而促進(jìn)腫瘤生長，或通過激活胰島素樣生長因子?1 受體（insulin?like growth factor?1 receptor， IGF?1）起作用。

研究［17］表明，無論在體內(nèi)還是體外，二甲雙胍依賴胰島素的抗腫瘤機(jī)制與胰島素受體（insulin?re?cepter， IR）表達(dá)降低，Akt和 ERK1／2 磷酸化（分別是P13K／Akt和RAS?MAPK通路中重要的下游因子）減少有關(guān)。因此，空腹胰島素水平（fasting insulin lev?els）和胰島素受體表達(dá)程度也許可以成為二甲雙胍治療敏感性的生物標(biāo)志。未來的前瞻性臨床試驗(yàn)將會(huì)更全面地鑒定生物標(biāo)志來預(yù)測(cè)二甲雙胍治療腫瘤的療效評(píng)價(jià)。但就患者個(gè)體而言，Akt和ERK1／2磷酸化的總體改變與循環(huán)中胰島素水平并不相關(guān)，提示這些因子減少也可能是由某一不依賴胰島素的通路介導(dǎo)。

4 二甲雙胍調(diào)節(jié)微小RNA表達(dá)

近年來發(fā)現(xiàn)，微小 RNA（microRNA，miRNA）在糖尿病與乳腺癌患者中的表達(dá)譜發(fā)生了不同程度的失調(diào)。研究［18］發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍誘導(dǎo)的抗癌效應(yīng)至少部分與miRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。它通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命過程。下面就最近發(fā)現(xiàn)的與二甲雙胍抗癌效應(yīng)相關(guān)的miRNA舉例說明。

4．1 miR?200c證據(jù)［19］表明 miR?200c 是一個(gè)腫瘤抑制因子。 miR?200c 過表達(dá)可減少 MDA?MB?231 和MCF?7乳腺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并與乳腺癌患者存活時(shí)間的延長顯著相關(guān)。一項(xiàng)研究［20］表明，在不同濃度（5、10、20 mM）的二甲雙胍治療后，乳腺癌細(xì)胞和腫瘤組織中增加了miR?200c的表達(dá)，且其作用是劑量依賴性的。另一方面，miR?200c的下調(diào)可減少乳腺癌細(xì)胞凋亡，但二甲雙胍治療后可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。同樣miR?200c下調(diào)也可以增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移和浸潤的能力。該試驗(yàn)給予10 mM二甲雙胍治療達(dá)到48 h后同樣逆轉(zhuǎn)了這種作用，即抑制了遷移和浸潤。機(jī)制可能為乳腺癌細(xì)胞中miR?200c的上調(diào)導(dǎo)致AKT2和Bcl?2的抑制，而miR?200c下調(diào)則進(jìn)一步上調(diào)了 AKT2和 Bcl?2，促進(jìn)了乳腺癌的進(jìn)展。AKT2是乳腺癌的凋亡抑制因子和細(xì)胞存活因子。該研究認(rèn)為，改變AKT2的表達(dá)可能至少是影響二甲雙胍抗腫瘤活性機(jī)制的一部分。但目前還沒有研究證明miR?200c和AKT2之間的直接關(guān)系。而最近的一項(xiàng)相關(guān)研究［21］表明，Bcl?2 是 miR?200c 的直接靶點(diǎn)。

4．2 miR?27a最近有研究［22］表明，用 20 mmol／L二甲雙胍處理乳腺癌 MCF?7細(xì)胞48 h后的 qRT?PCR結(jié)果顯示，二甲雙胍處理后miR?27a的表達(dá)相比對(duì)照組顯著降低80%。研究人員認(rèn)為miR?27a抑制乳腺癌MCF?7細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)增殖。二甲雙胍抑制人乳腺癌MCF?7細(xì)胞增殖作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。P53的表達(dá)可能增加，且caspase?3被激活，導(dǎo)致乳腺癌MCF?7細(xì)胞的凋亡。且熒光素酶測(cè)定證實(shí)了 miR?27a與 AMPKα2 的 3′?UTR 結(jié)合，意味著二甲雙胍可以增加AMPKα2的表達(dá)。

4．3 miR?21?5p二甲雙胍對(duì) miR?21?5p 水平的影響可能是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。最近研究［23］發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中應(yīng)用二甲雙胍都使miR?21?5p水平下調(diào)。已知E2F3具有轉(zhuǎn)錄抑制能力。在二甲雙胍治療后的時(shí)間內(nèi)顯示E2F3轉(zhuǎn)錄水平的增加，這使得該因子在 miR?21?5p 啟動(dòng)子上結(jié)合增加。 miR?21?5p的下調(diào)主要發(fā)生在E2F3增加其啟動(dòng)子結(jié)合率后的轉(zhuǎn)錄水平。該研究還認(rèn)為二甲雙胍可通過miR?21?5p調(diào)控的支架蛋白CAB39L和SESN1調(diào)節(jié)AMPK?mTOR信號(hào)，并且這一作用通過模擬CAB39L和SESN1的過度表達(dá)或下調(diào)miR?21?5p實(shí)現(xiàn)。

5 二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥性

對(duì)于許多惡性腫瘤來說，最初成功治療之后多藥物耐藥性的出現(xiàn)是一個(gè)巨大的難題。乳腺癌的早期診斷篩選以及合并療法的先進(jìn)性大大提高了存活期和治愈率［24］。然而很多患者多年后腫瘤會(huì)復(fù)發(fā)，產(chǎn)生多種藥物耐藥性（multiple drug resistant， MDR），因此研制出一種非毒性療法以及預(yù)防多重耐藥性腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要。MDR相關(guān)蛋白主要包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族比如MDR1和BCRP。這些蛋白作為藥物輸出泵的過度表達(dá)與藥物抗性相關(guān)。Davies等［25］選取了阿霉素作為乳腺癌MCF7細(xì)胞系的抗性藥物。該研究表明二甲雙胍可以逆轉(zhuǎn)MDR相關(guān)蛋白標(biāo)記的水平，使MDR乳腺癌細(xì)胞對(duì)其最初治療重新敏感。研究中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍在具有藥物抗性的MCF7細(xì)胞中的抗增殖作用是不依賴NF?κB和AMPK的。二甲雙胍通過間接抑制組蛋白脫乙酰酶的活性對(duì)組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾來發(fā)揮抗癌癥細(xì)胞的增殖作用。二甲雙胍降低了MDR1和BCRP的表達(dá)，在降低了癌癥相關(guān)基因S6K磷酸化的同時(shí)降低了轉(zhuǎn)錄因子HIF1α水平。在體外細(xì)胞抗性培養(yǎng)過程中用二甲雙胍預(yù)處理細(xì)胞并且始終維持二甲雙胍的存在，能夠阻止甚至延遲MDR標(biāo)記蛋白的聚集（MDR1、BCRP等），使其保持了藥物的敏感性，這為二甲雙胍成為長期的口服藥物來阻止腫瘤藥物抗性發(fā)展提供可能。P?gp作為MDR1的基因產(chǎn)物，是一個(gè)主要的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)藥物結(jié)合到P?gp的時(shí)候它們就會(huì)泵出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的降低和效力的丟失。最新的研究［26］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的MDR是通過降低P?gp的活性，從而抑制阿霉素的泵出，增強(qiáng)了P?gp過表達(dá) MCF?7細(xì)胞對(duì)其的敏感性，但是二甲雙胍不會(huì)降低P?gp的表達(dá)。確定二甲雙胍的這種影響是長久性的還是短期的可能是下一步計(jì)劃的研究方向。還有研究［27］表明，二甲雙胍也可以和2?脫氧葡萄糖結(jié)合逆轉(zhuǎn)MCF?7／Dox細(xì)胞的多藥物耐藥性，這是通過恢復(fù)p53功能同時(shí)增加阿霉素的積累來實(shí)現(xiàn)的。此外，阿霉素通過加重二甲雙胍和2?脫氧葡萄糖引起的代謝應(yīng)激，選擇性增加MCF?7／Dox凋亡，這種相輔相成作用使二甲雙胍和2?脫氧葡萄糖的結(jié)合對(duì)逆轉(zhuǎn)MDR有較好的效果。這兩種藥物的結(jié)合對(duì)P?gp mRNA表達(dá)和P?gp ATP酶活性沒有影響。

6 二甲雙胍抑制乳腺腫瘤干細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞能夠引發(fā)腫瘤發(fā)生，其與腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。二甲雙胍可以選擇性靶向乳腺癌干細(xì)胞，當(dāng)結(jié)合化療時(shí)能夠顯著減少乳房腫瘤的生長，并延長緩解期［28］。 Soo 等［29］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍在與環(huán)磷酰胺合并化療時(shí)，在乳腺癌干細(xì)胞中是不依賴AMPK發(fā)生的，而在親代乳腺癌細(xì)胞系中是依賴AMPK的，這說明二甲雙胍在腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)制可能與親代細(xì)胞系存在不同。二甲雙胍在乳腺癌干細(xì)胞中加快了葡萄糖的消耗，產(chǎn)生了更多的乳酸，細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生嚴(yán)重受阻，引發(fā)能量危機(jī)，損害了腫瘤干細(xì)胞修復(fù)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)的DNA損傷。在乳腺癌干細(xì)胞中，二甲雙胍降低了RAS原癌基因家族Rab27A的表達(dá)，而之前報(bào)道Rab27A的過度表達(dá)會(huì)促進(jìn)乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移［30］。BRCA1突變引起的RANKL過表達(dá)，使其突變攜帶者發(fā)展出具有干細(xì)胞樣性質(zhì)的侵襲性乳腺腫瘤，有學(xué)者［31］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠阻止這一過程發(fā)生的同時(shí)，還會(huì)降低乳腺癌干細(xì)胞數(shù)量，提高RANKL抗體（狄諾塞麥）的抗腫瘤活性。這為二甲雙胍合并狄諾塞麥聯(lián)合治療RANKL相關(guān)的乳腺腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移提供證據(jù)。研究證明二甲雙胍在不同類型的乳腺腫瘤中通過降低CSC特殊基因的表達(dá)抑制相關(guān)的炎癥反應(yīng)，所以相對(duì)于非腫瘤干細(xì)胞來說更優(yōu)先殺死腫瘤干細(xì)胞。最近有報(bào)道二甲雙胍可以通過PKA?GSK3β?KLF5通路來下調(diào)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子KLF5的表達(dá)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過抑制PKA活性，進(jìn)而激活GSK3β，而活化的GSK3β直接磷酸化KLF5，磷酸化的KLF5進(jìn)而被泛素?蛋白酶體系統(tǒng)降解。在三陰性乳腺癌臨床樣本中，利用免疫組化染色的方法發(fā)現(xiàn)PKA高度活化，p?GSK3β以及 KLF5高表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果揭示PKA活化程度、p?GSK3β表達(dá)均與KLF5表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，從而抑制三陰性乳腺癌干細(xì)胞，為三陰性乳腺癌的治療提供靶點(diǎn)［32］。

7 二甲雙胍治療乳腺癌的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

目前已有大量觀察性研究以及前瞻性研究在人群中證實(shí)二甲雙胍的抗乳腺癌作用，但如何應(yīng)用于臨床治療仍有待進(jìn)一步研究。關(guān)鍵問題之一為二甲雙胍抗乳腺癌的治療劑量。一項(xiàng)體外研究［33］顯示二甲雙胍抑制癌細(xì)胞增殖的濃度比治療糖尿病的藥物濃度至少高出10倍。總的來說，二甲雙胍安全性較高，最嚴(yán)重副反應(yīng)為乳酸酸中毒，但極其罕見，而且其發(fā)生低血糖的概率在2型糖尿病患者或正常人群中均較低［34］。而在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中，二甲雙胍是Ⅲ類藥物，原因?yàn)槠渚哂休^低的口服生物利用度（F＝55%±16%）且半衰期約為 5 h［35］。 尚沒有一個(gè)能夠負(fù)載足夠劑量二甲雙胍或控制其釋放速率的載體。最新的一項(xiàng)研究［36］提示生物相容性凝膠可能延長其在注射部位的停留時(shí)間，并通過其高度粘稠的結(jié)構(gòu)特性控制二甲雙胍的釋放。以藥用高分子材料泊洛沙姆（Poloxamer）407和124為負(fù)載的無菌二甲雙胍制劑，在室溫下注射可在體溫下發(fā)生溶膠到凝膠的轉(zhuǎn)變，且已被證明可在5℃的環(huán)境下儲(chǔ)存一個(gè)月。藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明，從給藥開始至48 h可明顯在血漿中檢測(cè)到二甲雙胍，更重要的是，藥物在組織積聚的水平顯著高于血漿中觀察到的水平。低劑量連續(xù)釋放二甲雙胍可使藥物在腫瘤內(nèi)顯著聚積，并發(fā)揮抗增殖和促凋亡活性。研究者認(rèn)為該熱敏凝膠制劑具有良好的穩(wěn)定性、耐受性、熱變性和流變性，其既可以達(dá)到滿意的療效，又可以避免血漿中極高的藥物濃度帶來的副作用，是進(jìn)一步研究輔助癌癥治療的新工具。

8 結(jié)論與展望

二甲雙胍對(duì)乳腺癌具有一定的抗腫瘤作用已逐漸被認(rèn)可。但是，二甲雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞的分子機(jī)制及臨床應(yīng)用的療效仍不確切。最新的研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可抑制存在耐藥性的乳腺癌發(fā)展并提高其復(fù)敏性，這為二甲雙胍作為長期的口服藥物來阻止腫瘤耐藥性發(fā)展提供了理論依據(jù)。除本文所提到的miRNA外，尚有其他種類miRNA可能在抑制腫瘤增殖，促進(jìn)凋亡中起作用。另外，對(duì)二甲雙胍抑制腫瘤干細(xì)胞機(jī)制的研究為治療三陰性乳腺癌提供了潛在的藥物靶點(diǎn)。但其與抑制腫瘤細(xì)胞的通路究竟是何種關(guān)系仍需進(jìn)一步的研究。因此需要未來更多探索以明確二甲雙胍的作用機(jī)制及臨床適用征。筆者認(rèn)為未來幾年的研究方向可能包含直接和間接效應(yīng)在二甲雙胍機(jī)制中的比例，劑量的探索及如何準(zhǔn)確快速地判斷患者使用二甲雙胍是否獲益三個(gè)方面，因?yàn)檫@些直接關(guān)系到在非糖尿病的癌癥患者中是否適用及達(dá)到最佳抗癌效果所需劑量等臨床實(shí)際問題。