薛洪省，韓 麗，李建新，錢海利，趙志龍

（1大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連116600；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100021）

0 引言

肺癌作為人類癌癥致死的首要原因，其中小細(xì)胞肺癌（small cell lung cance，SCLC）約占肺癌總數(shù)的13%［1］，對(duì)于老年抽煙患者是一種死亡率較高的疾病。其腫瘤細(xì)胞生長迅速、早期轉(zhuǎn)移以及早期對(duì)化療藥物出現(xiàn)耐藥等問題均可以影響臨床治療效果。近40年間，無論外科手術(shù)還是化學(xué)藥物在預(yù)后方面均未取得滿意效果［2］。通過對(duì)SCLC分子生物學(xué)的研究，其惡性生物學(xué)行為逐步被揭示，新的化學(xué)藥物以及靶向藥物已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

肺癌形成是由于在基因轉(zhuǎn)錄過程中堿基異常錯(cuò)配所引起的長期累積結(jié)果。在多種惡性性腫瘤中均普遍高表達(dá)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（metastasis associated protein 1， MTA1）［3－4］。 MTA 家族包括 6 個(gè)不同亞型，分 別 為： MTA1、 MTA1s、 MTA1?ZG29p、 MTA2、MTA3及 MTA3L［5］。MTA1作為染色質(zhì)核重塑和核小體去乙?；飶?fù)合體（NuRD復(fù)合體）成員之一，主要通過調(diào)控靶基因染色質(zhì)重構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄［6］。研究［7］提示，人類多種惡性腫瘤如乳腺癌、口腔鱗癌、食管鱗癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cance，NSCLC）均與MTA1過表達(dá)密切相關(guān)。然而，SCLC中有關(guān)MTA1研究尚少，主要發(fā)病機(jī)制尚未明確。為了研究SCLC中MTA1的表達(dá)及功能機(jī)制，我們通過人SCLC及正常肺組織芯片、肺癌細(xì)胞株及MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠探索MTA1在體內(nèi)外的表達(dá)、功能及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1．1 SCLC及正常肺組織石蠟包埋組合芯片芯片中包含SCLC組織40例，正常肺組織10例，每張芯片中包含2點(diǎn)相同的組織標(biāo)本（西安艾麗娜生物公司、附TNM和臨床分期）。

MTA1和 SOX2染色強(qiáng)度評(píng)分：0（陰性）、1（弱陽性）、2（中陽性）、3（強(qiáng)陽性）；MTA1 和 SOX2 染色陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：0（0%～10%）、1（＞10%～25%）、2（＞25%～50%）、3（＞50%～75%）、4（＞75%～100%）。染色評(píng)分為染色強(qiáng)度評(píng)分和染色陽性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積［8］。＞8分為強(qiáng)表達(dá)，≤8分為弱表達(dá)。

1．2 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件人SCLC細(xì)胞系NCI?H446，人 NSCLC 細(xì)胞系 NCI?A549 和 NCI?H1650，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%小牛血清、盤尼西林（100 U／mL）、鏈霉素（100 mg／mL）的 RPMI 1640。細(xì)胞孵育在含有5%CO2，37℃的濕潤培養(yǎng)箱中。

1．3 MTA1小干擾RNA轉(zhuǎn)染MTA1小干擾RNA（MTA1?siRNA）和陰性對(duì)照 siRNA（NC?siRNA，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）按照試劑操作說明書進(jìn)行，其中空白對(duì)照組（mock）為僅加入Lipofectamine2000（Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染試劑。

1．4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 使用Trizol試劑按照試劑操作說明提取細(xì)胞RNA。MTA1擴(kuò)增的有義引物5′?CAGCTACGAGCAGCACAACG?3′和 反 義 引 物 5′?TGTCCGTGGTTTGCCAGA?3′。 內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的有義引物 5′?GGTGGTCTCCTCTGACT?TCAACA?3′和 反 義 引物 5′?GTTGCTGTAGCCAAAT?TCGTTGT?3′。 PCR 條件：預(yù)變性 94℃ 60 s，40 個(gè)循環(huán)，94℃ 60 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。

1．5 免疫印跡分析（western blot） 組織及細(xì)胞蛋白提取、濃度測定、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別與抗MTA1多克隆抗體（1 ∶1000，Abcam），抗?β?actin 單克隆抗體（1 ∶10000，Abcam），抗 E?cadherin 多克隆抗體（1 ∶1000，Abcam），抗?PARP 多克隆抗體（1 ∶1000，Cell Signaling），抗?puma 多克隆抗體（1 ∶1000，Cell Signaling），抗?CyclinD1 多克隆抗體（1 ∶500，BIO?WORLD），抗?CyclinE1 多克隆抗體（1 ∶500，BIO?WORLD），抗?SOX2 多克隆抗體（1 ∶1000，Abcam），抗?OCT4多克隆抗體（1∶1000，Abcam）進(jìn)行封閉雜交，然后分別和對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫雜交孵育，最后通過 LAS?4000自動(dòng)曝光系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測。

1．6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將3×103細(xì)胞／孔接種于含有完全培養(yǎng)基中的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為100 μL的不含血清培養(yǎng)基及10 μL的MTS試劑混合液，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后利用酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)板各孔在λ＝490 nm處的吸光度。

1．7 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)使用完全培養(yǎng)基將收獲轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞懸浮成1×103個(gè)細(xì)胞／mL，然后在6孔板中分別加入0．5 mL的懸浮液及2．5 mL完全細(xì)胞培養(yǎng)基，搖勻后靜置于培養(yǎng)箱中10 d，然后用含0．2%結(jié)晶紫染料固定染色10 min，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照分析。

1．8 免疫組化組織固定、包埋、切片后經(jīng)烤片、石蠟脫水、抗原修復(fù)、沖洗、封閉。加入抗MTA1多克隆抗體（1 ∶100，Abcam）、抗 SOX2多克隆抗體（1 ∶100，Abcam）4℃避光孵育過夜，洗滌后取PV?9000 Immu?no?Bridge免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物公司）按照操作說明書進(jìn)行。進(jìn)行DAB顯色。顯色充分后終止反應(yīng)。復(fù)染、反藍(lán)、脫水、中性樹脂封片。

1．9 轉(zhuǎn)基因小鼠MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供，實(shí)驗(yàn)室使用許可證［SYSKS（京）2008?0025］。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員批準(zhǔn)（ILAS?002），MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠具體制備步驟見文獻(xiàn)［9］。

1．10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用均值和T檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 SCLC組織和細(xì)胞中MTA1呈高表達(dá)狀態(tài)在SCLC細(xì)胞NCI?H466中，通過 PCR及 western blot檢測到MTA1高表達(dá)，且較NSCLC細(xì)胞系NCI?A549及NCI?H1650表達(dá)水平顯著增高（圖1A）。利用包括40例SCLC組織和10例正常肺組織的組織芯片（圖1B），進(jìn)行免疫組化染色，顯示SCLC中的MTA1表達(dá)評(píng)分較正常肺組織顯著增高（P＝0．003，圖 1C）。同時(shí)，SCLC 組織 MTA1表達(dá)在性別（P＝0．399）、年齡（P＝0．999）、腫瘤分期（T 分期：P ＝0．478、N 分期：P＝0．814、M 分期：P ＝ 0．119）各亞組中無顯著差異（表 1）。

圖1 SCLC組織芯片及細(xì)胞系中MTA1呈高表達(dá)狀態(tài)

表1 MTA1蛋白表達(dá)與SCLC患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

2．2 下調(diào)MTA1表達(dá)后，SCLC細(xì)胞增殖能力明顯下降對(duì)比 NC?siRNA組，MTA1?siRNA組的 SCLC細(xì)胞中MTA1表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖2A、B），同時(shí)，SCLC細(xì)胞增殖能力（P＝0．022）和細(xì)胞克隆形成能力（P＝0．038）顯著降低（圖 2C、D）。

圖2 下調(diào)MTA1表達(dá)后，SCLC細(xì)胞增殖能力明顯下降

2．3 MTA1表達(dá)下調(diào)后，SCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)能力顯著下降對(duì)比 NC?siRNA 組，MTA1?siRNA 組SCLC細(xì)胞中E?cadherin蛋白表達(dá)量明顯增高。凋亡相關(guān)蛋白PUMA表達(dá)亦明顯增加，各組中周期相關(guān)蛋白cyclin E1和 cyclin D1無明顯變化（圖3）。

圖3 MTA1表達(dá)下調(diào)后，SCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)能力顯著下降

2．4 MTA1通過調(diào)控干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2參與SCLC的惡性生物學(xué)進(jìn)程通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)肺癌中與MTA1表達(dá)呈正相關(guān)的基因約有12 000個(gè)，SOX2相關(guān)系數(shù)為0．25（圖4A）。免疫組化結(jié)果對(duì)比正常肺組織，SCLC組織芯片中SOX2染色得分明顯增高（P＝0．015，圖 4B）。 對(duì)比 NC?siRNA 組，MTA1?siRNA組SCLC細(xì)胞中SOX2蛋白表達(dá)量明顯降低，Oct4表達(dá)無明顯差異（圖4C）。MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織MTA1和SOX2蛋白表達(dá)量均較野生型小鼠肺組織明顯增高（圖4D、E）。免疫組化結(jié)果提示MTA1同SOX2具有緊密的正相關(guān)性（r＝0．781，圖4F、G）。

3 討論

Sasaki在 2002年首次在 74例 SCLC中發(fā)現(xiàn)MTA1普遍高表達(dá)。因此，推斷MTA1與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)［10］。 之后，多項(xiàng)研究［11－14］證實(shí)MTA1在NSCLC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中具有促進(jìn)作用。MTA1作為染色質(zhì)重塑及核小體去乙?；瘡?fù)合體組成部分通過轉(zhuǎn)錄因子依賴的方式調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［15］，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄［16］，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［17］，涉及DNA的損傷修復(fù)［18］，并且正常組織中處于普遍低表達(dá)水平［19］。MTA1在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移方面具有重要價(jià)值，為評(píng)估腫瘤惡性程度、個(gè)體化治療及預(yù)后判斷指明了方向。

為了探索SCLC中MTA1的表達(dá)及功能，實(shí)驗(yàn)證實(shí)MTA1在肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，并且在SCLC細(xì)胞系NCI?H446中顯著高表達(dá)。通過siRNA下調(diào)SCLC中MTA1表達(dá)，SCLC的增殖及克隆能力顯著下降，揭示MTA1參與調(diào)控SCLC的生長和增殖。MTA1作為轉(zhuǎn)錄生長因子?β1的下游效應(yīng)器介導(dǎo) E?cadherin表達(dá)參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程，并發(fā)揮重要作用［20］。惡性腫瘤中E?cadherin蛋白表達(dá)缺失表現(xiàn)為腫瘤生長迅速、早期轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良等［21］。下調(diào)MTA1表達(dá)后E?cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，表明MTA1通過調(diào)控E?cadherin參與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。在DNA損傷修復(fù)方面，MTA1通過最為常見的PARP依賴途徑參與DNA損傷修復(fù)［20］。本研究通過下調(diào)MTA1后PARP出現(xiàn)了顯著的凋亡帶，Puma呈高表達(dá)，提示SCLC中MTA1通過PARP依賴方式參與DNA損傷修復(fù)。惡性腫瘤中MTA1過表達(dá)可激活cyclin D1通路［23］，cy?clin D1及cyclin E1表達(dá)無明顯變化，原因可能是SCLC中MTA1調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的作用機(jī)制不同。推斷MTA1在不影響SCLC細(xì)胞周期的方式下參與整個(gè)腫瘤進(jìn)程。

圖4 MTA1通過參與腫瘤干細(xì)胞調(diào)控促進(jìn)腫瘤惡性生物學(xué)行為

腫瘤發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程中均涉及腫瘤干細(xì)胞［24］。SOX2作為HMG DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員對(duì)胚胎干細(xì)胞全能性的發(fā)育起著重要作用，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［25］。SOX2在人類食管癌、NSCLC、SCLC 中呈現(xiàn)普遍高表達(dá)［26－28］。 研究［29］發(fā)現(xiàn)SOX2參與腫瘤干細(xì)胞進(jìn)程，并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長，下調(diào)SOX2表達(dá)后細(xì)胞生長受到明顯抑制。既往研究［30］表明過表達(dá)MTA1和SOX2后腫瘤表現(xiàn)為高侵襲性及高轉(zhuǎn)移性生長方式。在TCGA數(shù)據(jù)庫中通過分析發(fā)現(xiàn)總體肺癌中MTA1與SOX2呈中等相關(guān)性。至今，在SCLC中仍沒有關(guān)于MTA1與SOX2之間相互關(guān)系的可用數(shù)據(jù)。 研究［3，31－32］提示 MTA1 通過復(fù)雜的信號(hào)通路激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mes?enchymal transition，EMT），同樣有研究證實(shí)SOX2也參與了EMT過程。EMT在腫瘤干細(xì)胞特征維持方面處于基礎(chǔ)地位，并在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［33］。SCLC組織芯片結(jié)果提示腫瘤組織較正常組織MTA1顯著增高，但在性別、年齡、腫瘤TNM分期等亞組中MTA1表達(dá)無明顯差異，提示SCLC中MTA1普遍高表達(dá)，亦不排除病例數(shù)少造成的統(tǒng)計(jì)誤差。SCLC組織芯片結(jié)果提示MTA1與SOX2表達(dá)呈正相關(guān)，表明MTA1可能通過調(diào)控SOX2涉及到腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控過程中。對(duì)比野生型小鼠，MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中SOX2顯著高表達(dá)，更進(jìn)一步證實(shí)了MTA1與SOX2的正相關(guān)性。在TCGA數(shù)據(jù)庫中由于包含了大量NSCLC患者進(jìn)而造成二者相關(guān)性減小，而本研究數(shù)據(jù)彌補(bǔ)了TCGA中關(guān)于SCLC部分的空白。至此，在SCLC中提示MTA1可能通過EMT方式調(diào)控SOX2。

本研究表明在SCLC中MTA1作為關(guān)鍵調(diào)控因子通過調(diào)控SOX2參與腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程，并且在腫瘤的增殖、凋亡方面具有顯著影響。在SCLC惡性進(jìn)程中發(fā)揮著重要生物學(xué)作用，這將有可能為SCLC的治療帶來新的希望。