， ， ，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

多不飽和脂肪酸(PUFAs)具有重要的生理功能，在生物體的生長、發(fā)育及健康等方面都發(fā)揮了非常重要的作用，特別是PUFAs在增強(qiáng)及改善大腦學(xué)習(xí)記憶能力方面尤為突出[1-2].ω-3 PUFAs是大腦組織重要的組成成分，其中二十二碳六烯酸(DHA)占大腦皮層灰質(zhì)中脂肪酸總量的12%～16%[3].適量的補(bǔ)充PUFAs對各個(gè)年齡段人類的大腦認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶能力均有提高[4-6].盡管PUFAs制品具有良好的保健功能而被大眾所青睞，然而，PUFAs因含有較多的雙鍵，對氧氣、光和熱極為敏感，易發(fā)生氧化而失去其功效[7-9]，添加在食品中容易造成貨架期變短或腐敗期提前等問題.同時(shí)多不飽和脂肪酸一旦氧化，不僅失去生理功能，反而會(huì)對人體造成極大的危害[10-12]，因而使其應(yīng)用受到限制.而采用微膠囊技術(shù)可以增加多不飽和脂肪酸的穩(wěn)定性，提高它在功能性產(chǎn)品中的可用性.

多不飽和脂肪酸微膠囊以明膠與阿拉伯膠為壁材，采用噴霧干燥法將其制備成粉末狀多不飽和脂肪酸產(chǎn)品，包封率達(dá)到93.15%，負(fù)載量為13.68%.氧化穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，原料多不飽和脂肪酸初始過氧化值為0.19 mmol/kg，經(jīng)65 ℃加速氧化15 d后，未微膠囊化的多不飽和脂肪酸過氧化值增至29.85 mmol/kg，微膠囊化后多不飽和脂肪酸過氧化值僅為4.18 mmol/kg，微膠囊化后多不飽和脂肪酸的氧化穩(wěn)定性明顯提高.但微膠囊化后的多不飽和脂肪酸是否具有與液態(tài)多不飽和脂肪酸相同的提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用，相關(guān)的研究與報(bào)道很少.因此，本實(shí)驗(yàn)采用穿梭箱法和Morris水迷宮法，對多不飽和脂肪酸微膠囊改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多不飽和脂肪酸，購自西安欣祿生物科技有限公司，其中二十二碳六烯酸(DHA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%，二十碳五烯酸(EPA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%.多不飽和脂肪酸微膠囊(包封率為93.15%，負(fù)載量為13.68%)，實(shí)驗(yàn)室自制.吡拉西坦片，上海普康藥業(yè)有限公司.試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供.

雄性ICR小鼠，60只，18～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(合格證號(hào)：SCXK蘇2013-0003).

Morris水迷宮系統(tǒng)，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；BW-MAS104型小鼠穿梭箱，上海軟隆科技發(fā)展有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

60只雄性ICR小鼠自由飲水?dāng)z食3天以適應(yīng)環(huán)境，按體重每組10只隨機(jī)分為6組：空白對照組、多不飽和脂肪酸組(500 mg/kg，以體質(zhì)量計(jì))；多不飽和脂肪酸微膠囊低、中、高劑量組(100，500，1 000 mg/kg，以體質(zhì)量計(jì))以及吡拉西坦組(300 mg/kg，以體質(zhì)量計(jì)).以上劑量均按藥物重量計(jì)算，不包括輔料重量.空白對照組小鼠每日灌服等體積蒸餾水，每次給藥體積均按0.2 mL/10 g計(jì)算，各組灌胃1次/天.給藥周期為4周，試驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食，動(dòng)物房溫度控制在(25±2) ℃，濕度(65±10)%.

1.2.2 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測試(Morris水迷宮試驗(yàn)法)

采用Morris水迷宮試驗(yàn)法[13]，實(shí)驗(yàn)裝置是由Morris水迷宮和圖像監(jiān)測系統(tǒng)組成.Morris水迷宮裝置為直徑120 cm，高50 cm的圓形水池.根據(jù)直角坐標(biāo)，水池被等分為4個(gè)象限，分別為東北、東南、西北及西南象限，在西南象限正中距池壁33 cm處放有一個(gè)高29 cm，直徑9 cm的透明圓形平臺(tái)，平臺(tái)頂部低于水面1 cm(圖1).水溫控制在(25±3) ℃.迷宮上空通過攝像機(jī)與計(jì)算機(jī)相連，同步跟蹤小鼠在水中的運(yùn)行軌跡.當(dāng)已到設(shè)定的訓(xùn)練時(shí)間或小鼠主動(dòng)爬上平臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤，軟件可自動(dòng)得出小鼠找到平臺(tái)所需的時(shí)間(即潛伏期).給藥4周后開始進(jìn)行小鼠水迷宮訓(xùn)練.1) 定位航行試驗(yàn)：試驗(yàn)歷時(shí)5 d，訓(xùn)練時(shí)將平臺(tái)置于西南象限，將小鼠分別從池壁4個(gè)象限的中點(diǎn)頭朝池壁放入水中，記錄小鼠找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏期)，規(guī)定每次訓(xùn)練的時(shí)間為60 s.小鼠找到平臺(tái)后使其在平臺(tái)上保持15 s，如果小鼠在規(guī)定的60 s找不到平臺(tái)，須將其引導(dǎo)至平臺(tái)上，讓其保持15 s(此時(shí)潛伏期記為60 s).取實(shí)驗(yàn)前5天的逃避潛伏期，計(jì)算其平均值.2) 空間探索試驗(yàn)：在最后一次訓(xùn)練隔24 h后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去水下平臺(tái)，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿過平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)和停留在西南象限的時(shí)間.

圖1 Morris水迷宮Fig.1 Morris water maze

1.2.3 小鼠條件學(xué)習(xí)記憶能力測試(穿梭箱試驗(yàn)法)

采用穿梭箱試驗(yàn)法[14]，首次訓(xùn)練前，將小鼠放入穿梭箱內(nèi)(圖2)3 min，以適應(yīng)環(huán)境.開始訓(xùn)練時(shí)，將小鼠放入箱內(nèi)任何一側(cè)，背朝洞口.一開始先給予蜂鳴音刺激(條件刺激)，持續(xù)5 s，蜂鳴音后給小鼠以電刺激(100 V，50 Hz，AC)10 s.如果在蜂鳴音響后5 s內(nèi)，小鼠逃至另一側(cè)，則為主動(dòng)回避反應(yīng).如果在蜂鳴音響5 s后，小鼠才完成穿梭，則為被動(dòng)回避反應(yīng).若小鼠在蜂鳴音刺激與電刺激結(jié)束后仍留在同側(cè)，則為逃避失敗.小鼠每天訓(xùn)練10次，每次訓(xùn)練后休息15 s，連續(xù)訓(xùn)練5天.記錄小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間，并計(jì)算主動(dòng)回避反應(yīng)率(即主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)占穿梭總次數(shù)的百分比).

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 多不飽和脂肪酸微膠囊對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)

在第1天訓(xùn)練中，各組小鼠尋找平臺(tái)的平均潛伏期無明顯差異.從第2天開始，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增多，各組小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期均呈下降趨勢.多不飽和脂肪酸微膠囊組尋找平臺(tái)所用時(shí)間始終較空白對照組短，隨著給藥劑量的增多，其小鼠尋找平臺(tái)的平均潛伏期變短，且高、中劑量的多不飽和脂肪酸微膠囊組能明顯縮短尋找平臺(tái)潛伏期，差異顯著(P<0.05).未微膠囊化的多不飽和脂肪酸原料組小鼠尋找平臺(tái)的用時(shí)略高于多不飽和脂肪酸微膠囊組(中劑量)，但無顯著性差異(P>0.05)(表1).

表1 小鼠尋找平臺(tái)的平均潛伏期1)Table 1 Average latency of escaping to the platform for mice

注：1) *與空白對照組相比，有顯著差異(P<0.05)；**與空白對照組相比，有極顯著差異(P<0.01).同表2，3，4.

2.1.2 Morris水迷宮空間搜索試驗(yàn)

在Morris水迷宮空間搜索試驗(yàn)中，多不飽和脂肪酸微膠囊組(中劑量)小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和在平臺(tái)所在象限區(qū)域游泳時(shí)間所占比例高于未微膠囊化的多不飽和脂肪酸原料組，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).多不飽和脂肪酸微膠囊組小鼠末次穿越平臺(tái)次數(shù)(高、中劑量組差異顯著，P<0.05)和在平臺(tái)所在象限區(qū)域游泳時(shí)間所占比例(高、中劑量組差異顯著，P<0.05)較空白對照組顯著增多.多不飽和脂肪酸微膠囊組小鼠大多集中在平臺(tái)區(qū)域附近游動(dòng)，來回反復(fù)找尋目標(biāo)(表2).

2.2 多不飽和脂肪酸微膠囊對小鼠條件學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.2.1 主動(dòng)回避反應(yīng)率

在前2天的訓(xùn)練中，各組小鼠的穿梭箱主動(dòng)回避反應(yīng)率無明顯差異.從第3天開始多不飽和脂肪酸微膠囊高劑量組和吡拉西坦組小鼠的主動(dòng)回避反應(yīng)率明顯增加，與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.05).多不飽和脂肪酸微膠囊中劑量組和多不飽和脂肪酸組小鼠從第4天開始主動(dòng)回避反應(yīng)率較空白對照組顯著(P<0.05)提高(表3).且多不飽和脂肪酸微膠囊中劑量組小鼠主動(dòng)回避反應(yīng)率始終略高于多不飽和脂肪酸組，但無顯著性差異(P>0.05).

表2小鼠末次穿越平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)所在區(qū)域停留時(shí)間所占的比例

Table2Frequencyofcrossingtheplatformandproportionofswimmingtimeofmiceinthetargetarea

組別劑量/(mg·kg-1)跨臺(tái)數(shù)量/次停留時(shí)間占比/%空白對照組01.80±0.9326.34±8.02多不飽和脂肪酸組5003.01±1.1935.02±10.33微囊低劑量組1002.67±0.7430.53±8.39微囊中劑量組5003.51±1.03*35.19±7.64*微囊高劑量組10003.95±1.07**34.62±5.21*吡拉西坦組3005.13±1.15**41.14±7.28**

2.2.2 被動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間

由表4可知：未微膠囊化的多不飽和脂肪酸原料組與多不飽和脂肪酸微膠囊組小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間均低于空白對照組.未微膠囊化的多不飽和脂肪酸原料組小鼠動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間略高于多不飽和脂肪酸微膠囊組(中劑量)，但無顯著性差異(P>0.05).多不飽和脂肪酸微膠囊中劑量組從第4天開始，被動(dòng)逃避時(shí)間比空白對照組明顯縮短(P<0.05).高劑量組與空白對照組比較，從第3天開始，被動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間顯著縮短(P<0.05).低劑量組被動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間短于空白對照組，但無顯著差別.

表3 小鼠穿梭箱試驗(yàn)主動(dòng)回避反應(yīng)率Table 3 Results of the ratio active avoidance response in mice from shuttle box test

表4 小鼠穿梭箱試驗(yàn)被動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間(n=10)Table 4 Results of the passive avoidance response time in mice from shuttle box test(n=10)

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)根據(jù)《保健食品功能學(xué)評價(jià)程序和檢測方法》(2003版)，通過方向辨別性試驗(yàn)法—Morris水迷宮法與主動(dòng)回避性條件反射法—穿梭箱法，從不同的角度觀察經(jīng)多不飽和脂肪酸微膠囊給藥后小鼠的行為學(xué)變化、學(xué)習(xí)記憶的能力及變化.從整體上評估多不飽和脂肪酸微膠囊的學(xué)習(xí)記憶作用.穿梭箱結(jié)果顯示，與空白對照組相比，多不飽和脂肪酸微膠囊各劑量組的主動(dòng)回避反應(yīng)率和被動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間均優(yōu)于對照組，提示一定量的多不飽和脂肪酸微膠囊能夠提高小鼠的主動(dòng)回避記憶能力.在與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的大腦區(qū)域中，海馬的作用顯得尤為突出，它是被研究的最早以及最多的與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的腦區(qū)[15-16]，其與人或動(dòng)物的空間記憶密切相關(guān).Morris水迷宮是一種國際上公認(rèn)的研究與海馬功能相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型，可準(zhǔn)確的反應(yīng)受試動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力[17-19].本試驗(yàn)Morris水迷宮結(jié)果顯示，一定劑量的多不飽和脂肪酸微膠囊能提高試驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力，以多不飽和脂肪酸微膠囊高劑量組的效果最明顯.微囊中劑量組與多不飽和脂肪酸組試驗(yàn)結(jié)果差異的顯著性分析表明：微囊中劑量組在提高小鼠空間學(xué)習(xí)以及條件學(xué)習(xí)記憶水平方面均略優(yōu)于液態(tài)多不飽和脂肪酸組，但均無顯著性差異(P>0.05).總之，本試驗(yàn)制得的多不飽和脂肪酸微膠囊具有較高的包封率，可有效提高多不飽和脂肪酸的氧化穩(wěn)定性，在保持多不飽和脂肪酸原有生理活性的同時(shí)還提高了其吸收利用，因此在提高學(xué)習(xí)記憶能力方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景.

[1] 劉志國，王麗梅,王華林，等.多不飽和脂肪酸對大腦功能影響研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2015,36(21)：284-290.

[2] LABROUSSE V F, NADJAR A, JOFFRE C, et al. Short-term long chain omega3 diet protects from neuroinflammatory processes and memory impairment in aged mice[J]. Plos one,2012,7(5):e36861.

[3] CICCHETTI F, BOUSQUET M, CALON F. Impact of n-3 pufa in parkinson's disease: evidence from animal models[J]. Journal of neurochemistry,2013,125:59-60.

[4] MAKERIDES M. DHA supplementation during the perinatal period and neurodevelopment: do some babies benefit more than others?[J]. Prostaglandins leukotrienes & essential fatty acids,2013,88(1):87-90.

[5] 岳崟,王麗梅,劉仁祿,等.多不飽和脂肪酸與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國油脂,2015,40(4):38-41.

[6] YAMASHIMA T. A putative link of PUFA, GPR40 and adult-born hippocampal neurons for memory[J]. Progress in neurobiology,2008,84(2):105-15.

[7] SERFERT Y, DRUSCH S, SCHWARZ K. Chemical stabilisation of oils rich in long-chain polyunsaturated fatty acids during homogenisation, microencapsulation and storage[J]. Food chemistry,2009,113(4):1106-1112.

[8] 桑衛(wèi)國,丁玉庭,張朝暉,等.魚肝油精制前后光氧化的比較研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,29(2):115-119.

[9] 王雪青,苗惠,胡萍.膳食中多不飽和脂肪酸營養(yǎng)與生理功能的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2004,25(11):337-339.

[10] 王萍,張銀波,江木蘭.多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J].中國油脂,2008,33(12):42-46.

[11] TAMM F, GIES K, DIEKMANN S, et al. Whey protein hydrolysates reduce autoxidation in microencapsulated long chain polyunsaturated fatty acids[J]. European journal of lipid science & technology,2015,117(12):1960-1970.

[12] 魏東.微膠囊多不飽和脂肪酸粉末的氧化穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技,2007(7):88-89.

[13] 喻欣,郭蓮軍,艾永循,等.氯化銫對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2007,23(4):488-492.

[14] 徐叔云,陳修,卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M],北京:人民衛(wèi)生出版社,1991：661.

[15] ROLLS E T. A theory of hippocampal function in memory[J]. Hippocampus,2015,6(6):601-620.

[16] GOGTAY N, NUGENT T F, HERMAN D H, et al. Dynamic mapping of normal human hippocampal development[J]. Hippocampus,2006,16(8):664-672.

[17] 方松,余化霖.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中海馬相關(guān)空間學(xué)習(xí)記憶的研究進(jìn)展[J].臨床與病理雜志,2010,30(4):321-326.

[18] VORHEES C V, WILLIAMS M T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J]. Nature protocol,2006,1(2):848-858.

[19] 羅小泉,駱利平,陳海芳,等.Morris水迷宮檢測大鼠記憶力方法的探討[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010,21(11):2667-2669.