，，， ， ，章偉

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

隨著人類抗生素的濫用，耐藥菌的數(shù)量越來越多，甚至出現(xiàn)了“超級細菌”，傳統(tǒng)的抗生素治療感染性疾病已難以達到預(yù)期的效果.因此，尋找新型抗菌物質(zhì)、解決細菌對抗菌藥物的耐藥性問題已經(jīng)成為了全球緊迫的研究課題.群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)是一種通過信號分子的濃度來協(xié)同控制細菌周圍環(huán)境中自身或其他細菌的數(shù)量變化的現(xiàn)象.當細菌種群數(shù)量增多時，胞外信號分子密度增加，達到臨界值后擴散到胞內(nèi)并與受體蛋白靶向結(jié)合，從而控制特殊基因的表達，群體感應(yīng)可以調(diào)控細菌的生理現(xiàn)象，如鞭毛運動、細菌發(fā)光和生物膜等[1-5].QS主要分為3類：G-菌的?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)介導(dǎo)的LuxI-LuxR型QS系統(tǒng)；G+菌的寡肽介導(dǎo)的QS系統(tǒng)；種間信號呋喃酮酰胺硼酸二酯介導(dǎo)的QS系統(tǒng)[6].QSIs是阻斷細菌的QS從而抑制特殊的基因表達的物質(zhì).與傳統(tǒng)抗生素相比群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)就是在抑制毒素分泌，影響細菌生理活動的過程中并不影響細菌的生長，因此不會引起細菌耐藥性的產(chǎn)生[7].以干擾細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標開發(fā)新型的抗菌藥物，為解決細菌的耐藥性提供了一條新的研究思路.

Raoultellasp.Pan22x是實驗室從東海北緯29.995 6度，東經(jīng)122.394 2度海域海面海水，海泥，海藻樣品中分離得到具有群體感應(yīng)抑制活性拉烏爾菌.國內(nèi)外沒有報道過對拉烏爾菌具有群體感應(yīng)抑制活性的研究.產(chǎn)生活性次級代謝產(chǎn)物不僅與菌種的本身特性有關(guān)，還與菌種生存環(huán)境培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件息息相關(guān).只有在合適的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件下，才能使菌種的優(yōu)良性狀得到充分的發(fā)揮，來提高產(chǎn)物產(chǎn)量和活性.培養(yǎng)基的組成成分包括碳源、氮源和無機鹽等.培養(yǎng)條件優(yōu)化包括pH、溫度、接種量和培養(yǎng)時間等，因此，欲提高產(chǎn)物的產(chǎn)量以及活性，需要對培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件進行工藝優(yōu)化.以實驗室分離的拉烏爾菌Raoultellasp.Pan22x為出發(fā)菌株，通過單因素以及正交分析設(shè)計試驗對菌種的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行初步研究，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

拉烏爾菌Pan22x于2014年4月從東海北緯29.995 6度，東經(jīng)122.394 2度海域海面海水、海泥海藻樣品中分離得到.

1.2 報告菌株來源

紫色桿菌ATCC12472和紫色桿菌CV026由美國羅德島大學(xué)David C. Rowley教授提供.銅綠假單胞菌PAO1為實驗室保存.

1.3 培養(yǎng)基

LB海水瓊脂培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15～20 g/L，海鹽 33 g/L.

LB海水液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，海鹽33 g/L.

LB瓊脂培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L.

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L.

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選.選擇LB、ISP2、查氏、高氏一號、FP-1、PDA、陳海水LB培養(yǎng)基和LB為基本培養(yǎng)基.以5%的接種量將種子液分別接種到液體培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝液100 mL)，培養(yǎng)72 h.測粗提物的質(zhì)量和群體感應(yīng)抑制活性.

2) 碳源的篩選.分別加入10 g可溶性淀粉(A)、蔗糖(B)、葡萄糖(C)、乳糖(D)、β-環(huán)糊精(E)，麥芽糖(F)和正己烷(G)到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其他成分不變.其他條件同上，重復(fù)3次.

3) 氮源的篩選[8-9].分別加入牛肉浸膏(a)、大豆粉(b)、(NH4)2SO4(c)、NH4Cl(d)、尿素(e)、玉米粉(f)、魚粉蛋白胨(g)和NH4H2PO4(h)代替LB培養(yǎng)基中的蛋白胨(i)，其他條件同上，平行3次.

1.5 培養(yǎng)條件的的優(yōu)化

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，對菌株Raoultellasp.Pan22x初始pH值、溫度、接種量、發(fā)酵時間、搖床轉(zhuǎn)速及裝液量發(fā)酵條件進行優(yōu)化.將培養(yǎng)基初始pH值分別設(shè)為4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5；溫度分別調(diào)為20，26，30，33，37，40 ℃；轉(zhuǎn)速分別調(diào)為0，100，120，150，180，200 r/min；發(fā)酵時間分別調(diào)為24，48，72，96，120，144，168 h；在250 mL的三角瓶中，分別裝入40，60，80，100，120，140，160 mL發(fā)酵培養(yǎng)液；接種量分別設(shè)為裝液量的2%，6%，10%，14%，18%，22%；平行3次，其他發(fā)酵條件同1.4.測定粗提物質(zhì)量和群體感應(yīng)抑制活性.

1.6 粗提物的制備及活性物質(zhì)的檢測

發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清液加入等體積的乙酸乙酯萃取3次，濃縮至干稱質(zhì)量，后用甲醇溶解成50 mg/mL的溶液作為提取物.半透明圈抑制的測定：20 mL融化的固體LB培養(yǎng)基冷卻至40 ℃，加入10%過夜培養(yǎng)的紫色桿菌ATCC12472菌液，混勻后倒平板.待平板凝固后，用滅過菌的打孔器打孔，每個孔內(nèi)加20 μL提取物.用20 μL呋喃酮(0.5 mg/mL)作為陽性對照以及20 μL甲醇作為陰性對照.培養(yǎng)24 h，測定半透明抑制圈的大小.重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

良好的生長環(huán)境才能使菌種生長繁殖旺盛，代謝能力強，有利于代謝產(chǎn)物的生成.拉烏爾菌Raoultellasp.Pan22x在8種培養(yǎng)基中的生長狀況和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化情況如圖1所示.在LB培養(yǎng)基中粗提物的質(zhì)量和半透明圈直徑都達到最大值.雖然陳海水培養(yǎng)基發(fā)酵液活性好，但是粗提物質(zhì)量低.因此選用LB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基.

圖1 不同培養(yǎng)基對菌株Raoultella sp.Pan22x發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different culture media on Raoultella sp.Pan22x fermentation

2.2 碳源的種類的優(yōu)化

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分之一，為微生物提供能源.不同碳源對菌株Raoultellasp.Pan22x發(fā)酵代謝物質(zhì)具有顯著影響.不同質(zhì)量分數(shù)的碳源對發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量和活性有著明顯的影響，過少的碳源主要表現(xiàn)為促進作用，過多碳源反而會產(chǎn)生抑制作用.以淀粉為碳源的發(fā)酵粗提物質(zhì)量及半透明圈直徑均為最大值，粗提物質(zhì)量為62.75 mg,半透明圈直徑達11.67 mm；而以麥芽糖為碳源的發(fā)酵粗提物質(zhì)量達到最小值為38.33 mg；正己烷為碳源的半透明圈直徑最小為4.33 mm，因此選用淀粉作為培養(yǎng)基碳源(圖2).

圖2 不同碳源對菌株Raoultella sp.Pan22x發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the fermentation of Raoultella sp.Pan22x

2.3 氮源種類的優(yōu)化

不同的有機氮源對Pan22x發(fā)酵產(chǎn)物有著顯著影響，其中以蛋白胨作為氮源時，發(fā)酵液粗提物和半透明圈直徑達到最高，質(zhì)量為68.67 mg，半透明圈直徑為10 mm；大豆粉次之.相比于無機氮源，發(fā)酵液粗提物質(zhì)量和半透明圈直徑都有明顯的提高，因此選擇蛋白胨作為最優(yōu)氮源(圖3).

圖3 不同氮源對菌株Raoultella sp.Pan22x發(fā)酵的影響Fig.3 Effecst of different nitrogen sources on the fermentation of Raoultella sp. Pan22x

2.4 培養(yǎng)基組成正交實驗的優(yōu)化

通過上述培養(yǎng)基組成的單因素實驗，獲得最優(yōu)碳源為淀粉、氮源為蛋白胨.同時可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的成分及其含量都對菌體的生長和產(chǎn)物的形成有很大的影響.為進一步研究培養(yǎng)基的組成對菌株轉(zhuǎn)化能力的影響，以淀粉、蛋白胨、酵母浸粉和氯化鈉為4個因素，取他們的3個水平，設(shè)計一個正交實驗[10]，以半透明圈直徑為指標，再進行方差分析.因素和水平設(shè)計見表1，正交實驗結(jié)果見表2，方差分析見表3.

表1正交實驗設(shè)計因素水平表

Table1ThedesignoforthogonalcombinationexperimentbyL9(34) %

因素質(zhì)量分數(shù)淀粉蛋白胨酵母膏氯化鈉13.03.001.024.04.00.32.035.05.00.54.0

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal combination experiment

表3 正交實驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance for orthogonal test

通過直觀分析法統(tǒng)計分析，根據(jù)極差R的大小關(guān)系可以看出：影響產(chǎn)物群體感應(yīng)抑制活性大小的因素主次順序為蛋白胨>淀粉>酵母浸粉>氯化鈉，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為淀粉4%，蛋白胨4%,酵母浸粉0.3%,氯化鈉1%.

3 培養(yǎng)條件的的優(yōu)化

3.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

不同培養(yǎng)溫度對菌株Raoultellasp.Pan22x的活菌量和發(fā)酵液活性均有較大影響，菌株Raoultellasp.Pan22x在20～40 ℃時均可生長，其中在26～37 ℃時發(fā)酵液粗提物質(zhì)量較高；在發(fā)酵液活性方面，30 ℃時發(fā)酵液顯示出較強的活性，其半透明圈直徑可達12.67 mm，而40 ℃時發(fā)酵液活性較低(圖4).

圖4 不同培養(yǎng)溫度對菌株Raoultella sp.Pan22x發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of different incubation temperatures on the fermentation of Raoultella sp.Pan22x

3.2 初始pH的優(yōu)化

培養(yǎng)基的初始pH值對菌體的生長至關(guān)重要，影響發(fā)酵液產(chǎn)物的形成.菌株Raoultellasp.Pan22x在pH 4.5～9.5時均可生長，其中在pH 6.5～7.5時發(fā)酵液粗提物質(zhì)量較高，pH 4.5時菌株生長受到一定的抑制，說明弱堿條件有利于菌株生長；在發(fā)酵液活性方面，初始pH 6.5～7.5時的發(fā)酵液活性明顯高于pH 4.5～5.5時的發(fā)酵液活性.在pH 7.5時發(fā)酵液粗提物質(zhì)量和半透明圈活性均達到最佳值.因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值選為7.5最佳(圖5).

圖5 初始pH對菌株Raoultella sp.Pan22x發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of initial pH on Fermentation of Raoultella sp.Pan22x

3.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

搖床振蕩培養(yǎng)可以保持培養(yǎng)基良好的溶氧量，還可以使菌種與培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分充分接觸，促進發(fā)酵產(chǎn)物的生成.Raoultellasp.Pan22x在靜止和振蕩都能生長.100～180 r/min中發(fā)酵粗提物質(zhì)量較高，150，180 r/min時，產(chǎn)物活性最好，由于150 r/min質(zhì)量相對高，所以選擇150 r/min為最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速(圖6).

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對菌株Raoultella sp.Pan22x發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of shaking speed on Raoultella sp.Pan22x fermentation

3.4 接種量的優(yōu)化

在一定范圍內(nèi)，接種量的多少決定了菌種在培養(yǎng)基中生長繁殖速度的快慢.接種量在2%～22%時Raoultellasp.Pan22x發(fā)酵產(chǎn)物均有活性.在10%時粗提物質(zhì)量和活性都達到最優(yōu).在10%以后粗提物質(zhì)量和活性都有明顯的下降.因此選擇接種量為10%為最優(yōu)接種量(圖7).

圖7 接種量對菌株Raoultella sp.Pan22x發(fā)酵的影響Fig.7 Effects of inoculation amount on Fermentation of sRaoultella sp.Pan22x

3.5 裝液量的優(yōu)化

由于含氧量和營養(yǎng)物質(zhì)的影響，選擇最佳裝液量對產(chǎn)物質(zhì)量和活性都要明顯的影響.在250 mL錐形瓶中裝液量為100 mL時粗提物質(zhì)量和活性達到最大.當裝液量達到140 mL時，活菌量有所下降，且發(fā)酵液活性也降低，說明菌株Raoultellasp.Pan22x生長對含氧量和營養(yǎng)物質(zhì)有一定的要求.裝液量過少或過多，都不利于菌株的發(fā)酵.因此，選擇在250 mL錐形瓶中裝液100 mL為最佳裝液量(圖8).

圖8 裝液量對菌株P(guān)an22x發(fā)酵的影響Fig.8 Effects of liquid volume on Fermentation of strain Pan22x

3.6 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

發(fā)酵時間對發(fā)酵粗提物和發(fā)酵液活性有著影響，在培養(yǎng)12～120 h時，菌體發(fā)酵粗提物和活性維持較高的水平；在48～72 h，隨著時間的延長，菌體發(fā)酵液粗提物質(zhì)量和活性出現(xiàn)明顯下降趨勢；在發(fā)酵液粗提物質(zhì)量和活性方面，在96 h到達最大值；綜合以上結(jié)果，確定96 h為Raoultellasp.Pan22x菌株最佳發(fā)酵時間(圖9).因素和水平設(shè)計見表4，正交實驗結(jié)果見表5，方差分析見表6.

圖9 培養(yǎng)時間對菌株P(guān)an22x發(fā)酵的影響Fig.9 Effects of culture time on the fermentation of strain Pan22x

因素溫度/℃pH轉(zhuǎn)速/(r·min-1)接種量/%裝液量/mL培養(yǎng)時間/h1305.5120660722336.51501080963377.518014100120

表5 正交實驗結(jié)果Table 5 The result of orthogonal combination experiment

表6 正交實驗結(jié)果方差分析表Table 6 Analysis of variance for orthogonal test

通過直觀分析法統(tǒng)計分析，根據(jù)極差R的大小關(guān)系可以看出：影響產(chǎn)物群體感應(yīng)抑制活性大小的因素主次順序為接種量>溫度>pH>轉(zhuǎn)速>培養(yǎng)時間>裝液量.最優(yōu)發(fā)酵條件組合為D1A2B3C2F1E2，即:接種量10%，溫度30 ℃，pH 7.5，轉(zhuǎn)速 150 r/min，培養(yǎng)時間96 h，裝液量100 mL/250 mL.

4 結(jié) 論

對培養(yǎng)基成分和發(fā)酵優(yōu)化進行綜合驗證，菌種菌株Raoultellasp.Pan22x的最優(yōu)培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其配方為淀粉4%,酵母浸膏0.3%,蛋白胨4%，NaCl 1%.最優(yōu)發(fā)酵條件組合為30℃，pH 7.5，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間96 h，接種量為10%，裝液量為100 mL/250 mL.在優(yōu)化的各因素中,蛋白胨對Raoultellasp.Pan22x菌株產(chǎn)群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)影響最大，并且具有負效應(yīng)，即其質(zhì)量分數(shù)在一定范圍內(nèi)量越多,群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)越多，相比于無機氮源，有更好的效果，并且粗提物質(zhì)量普遍高于無機氮源的質(zhì)量，Raoultellasp.Pan22x在以有機氮源作為氮源時，生長速度和代謝情況相比以無機氮源作氮源時要好.在篩選菌株用陳海水LB培養(yǎng)基發(fā)酵時粗提物的質(zhì)量提高了4.2倍，群體感應(yīng)抑制活性提高了1.4倍.在發(fā)酵條件優(yōu)化中，接種量對Raoultellasp.Pan22x菌株產(chǎn)群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)影響最大，在10%最好，接種量過高，會導(dǎo)使菌體生長過旺，導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分和氧氣的消耗過快，造成營養(yǎng)和溶氧量不足，不利于產(chǎn)生活性物質(zhì).裝液量對其影響不大，在實際生產(chǎn)操作中，可適當增加裝液量.說明該工藝優(yōu)化有一定的效果和可行性，為群體感應(yīng)抑制的進一步研究提供了來源保障，并為工業(yè)化發(fā)酵Raoultellasp.Pan22x分離得到群體感應(yīng)抑制劑提供了借鑒.

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