張榮博 徐 彬 朱敏姿 周未瑩 吳 憂 梁順利 章水晶 李 錚 袁 強

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）為中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘病，實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是其常用動物模型，發(fā)病機制均為CD4+T細胞介導的細胞免疫[1-2]。EAE模型中樞神經系統(tǒng)血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）顯著增加，在介導T細胞通過血腦屏障侵入中樞神經系統(tǒng)過程中起重要作用[1，3-5]。山茱萸新苷可以在體外抑制臍靜脈表達VCAM-1[6]，本研究擬明確山茱萸新苷能否在EAE動物活體內抑制中樞神經系統(tǒng)表達VCAM-1，抑制免疫細胞浸潤，緩解EAE神經功能缺損癥狀。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 成年雄性Lewis大鼠[北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2010-0002]32只，SPF 級，體質量（360±10）g。普通級雄性DHP豚鼠 [浙江省湖州城區(qū)西風洋特種經濟動物養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK（浙）2013-0060]5只，體質量（300±8）g。

1.2 主要試劑 山茱萸新苷（成都普菲德生物技術有限公司，批號131015），福氏完全佐劑（Sigma公司，批號SLBK1731V），兔抗鼠VCAM-1多克隆抗體（Santa Cruz公司，批號K0212），山羊抗兔IgG二抗（Santa Cruz公司，批號B1711），Trizol（Bio Basic公司，批號 40950732），逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，批號CK1010），組織總蛋白提取試劑盒（Thermo Pierce公司，批號 PD199707）。

1.3 主要儀器 CFX384多重實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)及Mini Trans-Blot轉印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 動物模型制作 參考尹琳琳等[7]方法。取豚鼠5只，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，剝離脊髓，剪除脊膜和馬尾，研磨制作50%的豚鼠脊髓勻漿。取兩個10mL注射器，一個抽取豚鼠脊髓勻漿5mL，另一個抽取福氏完全佐劑5mL，用三通管對接，低溫下反復抽打乳化至油包水乳劑，放入4℃冰箱中備用。誘導EAE時，予Lewis大鼠皮下注射油包水乳劑（每只大鼠每個后足墊各注射0.1mL）。注射當天記為免疫后第0d，第二天記為免疫后第1d。每只大鼠僅在第0d注射1次油包水乳劑。

2.2 動物分組及處理 將Lewis大鼠隨機均分為正常對照組、模型組、強的松組和山茱萸新苷組，每組8只。后三組大鼠均制作EAE模型。正常對照組、模型組予灌胃生理鹽水；山茱萸新苷組予含有山茱萸新苷（135mg/kg）的生理鹽水灌胃；強的松組，予含有醋酸潑尼松龍（5mg/kg）的生理鹽水灌胃。以上組別均在免疫后第1d開始灌胃，1天1次，每次液體量均為1.5mL。

2.3 神經功能缺損癥狀評分 采用Corrêa等[8]的標準評分，0分：無神經功能缺損癥狀；1分：出現(xiàn)尾巴肌張力明顯減弱甚至消失，步態(tài)笨拙；2分：可見尾巴麻痹無力，雙后肢肌張力明顯減弱；3分：可及尾巴麻痹無力，后肢明顯癱瘓，疼痛等刺激后能移動；4分：前肢也出現(xiàn)癱瘓，伴大小便失禁；5分：接近死亡或者已經死亡。比較各組大鼠免疫后第14d神經功能缺損癥狀評分。

2.4 組織病理學觀察 免疫后第14d（有大鼠表現(xiàn)雙后肢明顯癱瘓并累及前肢，精神非常萎靡，進食不能的瀕死狀態(tài)，視為神經功能缺損癥狀達到最高峰）處死所有大鼠?？焖偃〕黾顾璨⒎侄?，新鮮頸胸段脊髓（每組8段）放入液氮，每組取4段進行實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-PCR），另外 4段進行Western Blotting。腰段脊髓（每組8段）制作石蠟切片，厚度4μm。每只大鼠從腰髓切片中隨機選取3張行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，低倍鏡下觀察全視野的病灶數(shù)后取平均數(shù)，即為每只大鼠的病灶數(shù)。炎性病灶判定：超過20個炎癥細胞浸潤或炎癥細胞圍繞小血管呈袖套樣改變[9]。

2.5 RT-PCR檢測頸胸段脊髓VCAM-1mRNA表達 使用軟件設計PCR引物。Rat VCAM-1，基因序列號NM_012889，上游引物5'-GATGTCATTGCGAGGTCGTTTAGA-3'，下游引物5'-GCATGAAGTTACAACAGTCAGTCCAAG-3'，擴增長度 97bp。Rat 18S（內參），基因序列號M11188，上游引物5'-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3'，下游引物5'-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3'，擴增長度105bp。

將分段好的新鮮頸胸段脊髓（每組4段）分別于液氮中研磨，提取總RNA，再逆轉錄合成cDNA。反應條件：95℃預變性 1min；40個循環(huán)：95℃，15sec；63℃，25sec；熔點曲線分析 55～95℃。目的基因的相對表達水平用相對表達量（2-△Ct×103）表示。

2.6 Western Blot檢測頸胸段脊髓VCAM-1蛋白的表達 新鮮頸胸段脊髓（每組4段）分別在液氮中研磨，提取總蛋白并定量，再經電泳、轉膜（100V恒壓下轉膜至聚偏二氟乙烯膜）、封閉（5%脫脂奶粉），加入一抗（兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗體，稀釋倍數(shù)1：500）4℃孵育過夜，加入二抗（山羊抗兔 IgG，稀釋倍數(shù)1:2000）室溫孵育。配置ECL工作液（約1mL），孵育轉印膜1min，保鮮膜密封，暗盒中曝光5～10min后顯影和定影。VCAM-1蛋白的相對表達量=VCAM-1蛋白（光密度值）/內參（光密度值）×103。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（±s） 表示，采用單因素方差分析。多個樣本均數(shù)間的兩兩比較方差齊時采用LSD法，若方差不齊則采用Tamhane's T2法。檢驗水準：α=0.05。

3 結果

3.1 各組大鼠神經功能缺損癥狀評分比較 免疫后第14d有3只大鼠出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，視作癥狀達到高峰期。正常對照組、模型組、強的松組和山茱萸新苷組神經功能缺損癥狀評分分別為：0分、（3.83±0.98）分、（0.67±0.82）分、（1.67±1.75）分，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=14.314，P=0.000），山茱萸新苷組與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.002），與強的松組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.126）。

3.2 各組大鼠腰髓免疫細胞浸潤及病灶個數(shù)比較模型組、強的松組、山茱萸新苷組大鼠腰髓均有免疫細胞浸潤，密集分布在血管周圍。山茱萸新苷組腰髓免疫細胞浸潤數(shù)量明顯少于模型組，稍多于強的松組，正常對照組腰髓極少有免疫細胞，見圖1（插頁）。四組大鼠炎性病灶個數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義（F=40.996，P=0.000），其中山茱萸新苷組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.037），見表1。

圖1 各組大鼠腰髓免疫細胞浸潤及病灶個數(shù)

3.3 各組大鼠VCAM-1mRNA表達比較 四組大鼠頸胸段脊髓內VCAM-1mRNA表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=137.485，P=0.000），其中山茱萸新苷組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012）。表明山茱萸新苷可在EAE動物活體內抑制中樞神經系統(tǒng)中VCAM-1mRNA的表達。見表1。

3.4 各組大鼠頸胸髓VCAM-1蛋白表達比較 四組大鼠頸胸段脊髓VCAM-1蛋白表達量的差異有統(tǒng)計學意義（F=54.594，P=0.000），山茱萸新苷組VCAM-1蛋白的表達明顯少于模型組（P=0.004）；山茱萸新苷組與強的松組VCAM-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P=0.082）。見表 1、圖2（插頁）。

圖2 各組大鼠脊髓VCAM-1蛋白表達比較

4 討 論

MS中醫(yī)辨證以肝腎陰虛為主，滋補肝腎貫穿治療始終[10-11]。山茱萸補肝益腎、澀精固脫，在治療MS中發(fā)揮重要作用[12]。含山茱萸的湯劑及山茱萸環(huán)烯醚帖苷均有緩解MS/EAE癥狀的作用[9，13-14]。山茱萸新苷屬于山茱萸環(huán)烯醚萜苷，本研究證實在癥狀高峰期，山茱萸新苷組神經功能評分明顯低于模型組（P<0.01），說明山茱萸新苷具有緩解EAE神經缺損癥狀作用。

表1 各組大鼠脊髓炎性病灶個數(shù)、VCAM-1mRNA、VCAM-1蛋白表達比較（±s）

表1 各組大鼠脊髓炎性病灶個數(shù)、VCAM-1mRNA、VCAM-1蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；VCAM-1：血管細胞黏附分子-1

組別正常對照組模型組強的松組山茱萸新苷組F值P值鼠數(shù)8888炎性病灶個數(shù)（個）08.75±2.23△△2.33±1.03△**4.83±1.47△△*40.9960.000VCAM-1mRNA相對表達量5.602±0.76137.762±4.560△△17.143±1.521△△**28.042±3.147△△*137.4850.000VCAM-1蛋白相對表達量7.958±2.26522.433±1.829△△15.725±1.338△△**18.625±0.874△△**54.5940.000

MS/EAE主要由CD4+T細胞介導，髓鞘特異性的CD4+T細胞輸注入正常小鼠體內，可誘導EAE[15]。髓鞘特異性CD4+T細胞在淋巴器官中發(fā)育成熟后釋放到血液中，隨血液到達中樞神經系統(tǒng)，穿過血腦屏障浸潤中樞神經系統(tǒng)并由抗原提呈細胞激活，通過細胞-細胞接觸、分泌促炎細胞因子來活化抗原提呈細胞，促炎細胞因子的分泌可以誘發(fā)大量免疫細胞浸潤中樞神經系統(tǒng)，并在中樞神經系統(tǒng)中激活、分泌大量炎癥因子，進而導致周圍神經組織損害[2]。本研究應用HE染色，在EAE大鼠的腰髓切片上，可觀察到大量免疫細胞浸潤。山茱萸新苷組免疫細胞浸潤明顯少于模型組大鼠，說明山茱萸新苷可以抑制免疫細胞浸潤EAE大鼠中樞神經系統(tǒng)。

CD4+T細胞通過血腦屏障浸潤中樞神經系統(tǒng)是致病關鍵，阻止該過程可抑制EAE病理過程。VCAM-1蛋白與配體整合素α4β1結合，介導白細胞招募、淋巴細胞歸巢，在EAE發(fā)病過程中表達增多，并在介導T細胞通過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)過程中起重要作用[1，3-5]。針對 VCAM-1配體的 α4亞單位的抗體那他珠單抗可減輕MS的癥狀[16]。因此抑制VCAM-1的表達有望抑制免疫細胞浸潤中樞神經系統(tǒng)進而緩解EAE癥狀。本研究證實，山茱萸新苷可以在EAE大鼠體內在mRNA及蛋白水平抑制中樞神經系統(tǒng)表達 VCAM-1（P<0.05，P<0.01）。

本研究顯示，山茱萸新苷可以顯著緩解EAE大鼠神經功能缺損癥狀，抑制免疫細胞浸潤中樞神經系統(tǒng)，以及抑制中樞神經系統(tǒng)表達VCAM-1。然而，山茱萸新苷抑制VCAM-1表達的機制尚不清楚。研究證實，激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）可以上調 VCAM-1的表達，抑制 NF-κB的活性可抑制TNF-α誘導的VCAM-1表達[17-18]。既往有研究顯示山茱萸新苷可抑制NF-κB的活性[19]。所以，山茱萸新苷有可能通過抑制NF-κB的活性，從而抑制中樞神經系統(tǒng)表達VCAM-1，進一步抑制炎性細胞浸潤，緩解EAE癥狀，但仍需實驗研究證實。

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