陸奇群 張 曦

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）指除酒精和明顯的肝損害因素之外的其他原因?qū)е碌?，病理特征為肝?xì)胞彌漫性大泡性脂肪變性的臨床綜合征[1]。在我國(guó)NAFLD患病率達(dá)20.9%～42%[2-3]。NAFLD可進(jìn)一步發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)楦渭?xì)胞癌（HCC）[4]。NAFLD患者罹患2型糖尿?。═2DM）及其并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于正常人[5]。流行病學(xué)調(diào)查[6]顯示，NAFLD為骨質(zhì)疏松、冠心病和結(jié)直腸腫瘤的高危因素。白藜蘆醇（resveratrol，Res）為一種非黃酮類(lèi)多酚化合物，已被證實(shí)可有效改善NAFLD小鼠肝臟病變程度[7]。自噬（autophagy）在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。自噬可降解肝細(xì)胞內(nèi)脂滴，減輕炎癥反應(yīng)，改善肝細(xì)胞脂肪變性[8]。本研究從自噬角度出發(fā)，觀察Res對(duì)NAFLD小鼠的改善作用及其對(duì)自噬相關(guān)蛋白p62和通路蛋白磷脂酰肌醇-3-羥基激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、絲氨酸-蘇氨酸激酶（serine-threonine kinase，AKt）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的影響，探討Res治療NAFLD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物 健康SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠45只，6周齡，體質(zhì)量18～20g，購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2016-0031。Res購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技公司，批號(hào)160504。

1.2 主要試劑和儀器 胰島素酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒，購(gòu)自美國(guó)R&D公司，批號(hào)SJH16887。血糖試紙購(gòu)自深圳瑞迪恩科技公司，批號(hào)TS21DD4Q2409。p62（批號(hào) 51145）、PI3K（批號(hào) 42925）、Akt、mTOR 一抗（批號(hào)29725）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號(hào)166818B。Western blotting相關(guān)試劑購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。DXC 800全自動(dòng)生化儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.3方法

1.3.1 造模和分組 參照文獻(xiàn)[9]予高脂飼料（68.5%基礎(chǔ)飼料＋15%豬油＋1%膽固醇＋15%糊精＋0.5%膽鹽）共8周復(fù)制小鼠NAFLD模型，并經(jīng)肝臟病理檢查符合NAFLD判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。將45只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為模型組、觀察組和正常對(duì)照組，各15只，均自由飲水。模型組和觀察組予高脂飼料復(fù)制NAFLD模型。造模成功后，模型組予高脂飼料＋生理鹽水10mL/kg，1天1次灌胃，觀察組予高脂飼料＋Res 100mg/kg，1天1次灌胃，連續(xù)2周。正常對(duì)照組始終予基礎(chǔ)飼料。

1.3.2 標(biāo)本采集 給藥結(jié)束后，禁食12h，以2%戊巴比妥麻醉后，股動(dòng)脈放血法處死小鼠，取3mL血離心取上清以檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)，同時(shí)取肝臟組織適量制成勻漿用于Western blot檢測(cè)。

1.3.3 血清學(xué)指標(biāo) 血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。血清空腹血糖（FBG）和胰島素（FINS）水平分別采用試紙和ELISA試劑盒測(cè)定。胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FINS（mU/L）×[FBG（mmol/L）/22.5][11]。

1.3.4 Western blot檢測(cè)p62及通路蛋白 取適量肝臟組織經(jīng)勻漿離心后，加蛋白裂解液，提取總蛋白。取30～50μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠100V 1h電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉液中37℃ 2h；加入 p62、PI3K、Akt、mTOR 一抗 4℃過(guò)夜。反復(fù)洗膜1h，加入二抗孵育1h，洗膜后加入ECL發(fā)光劑孵育5min，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像。采用Gel Pro3.0軟件測(cè)定條帶積分光密度值（OD），以目的蛋白的OD值與內(nèi)參的OD值的比值作為目的蛋白的相對(duì)OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料采用（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清學(xué)指標(biāo)比較 與正常對(duì)照組比較，模型組血清TG、TC、ALT、AST水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，觀察組血清 TG、TC、ALT、AST水平均顯著降低（P＜0.05）。各組FBG水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型組HOMA-IR水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，觀察組HOMA-IR水平顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠p62及通路蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織中p62、PI3K、磷酸化（p）-Akt、p-mTOR 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，觀察組肝組織中 p62、PI3K、p-Akt、p-mTOR 水平均顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1（插頁(yè)）、表 2。

圖1各組小鼠p 62及通路蛋白的表達(dá)

3 討 論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，遺傳因素、代謝紊亂、脂質(zhì)過(guò)氧化及炎癥因子失衡等多種因素均發(fā)揮重要作用，而胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）為公認(rèn)的關(guān)鍵因素。IR可促進(jìn)脂質(zhì)代謝紊亂，促使過(guò)多的游離脂肪酸向肝細(xì)胞聚集，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞脂肪變[11]。而且，過(guò)多游離脂肪酸可損傷線粒體，并造成氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量氧自由基（ROS）[8]。

表1 各組小鼠血清學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1 各組小鼠血清學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；TG：甘油三酯，TC：總膽固醇，ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶，F(xiàn)BG：血清空腹血糖，HOMA-IR：胰島素抵抗指數(shù)

組別正常對(duì)照組模型組觀察組只數(shù)151515TG（mmol/L）0.72±0.124.55±0.28*1.86±0.18*△TC（mmol/L）3.15±0.268.79±0.35*5.36±0.31*△ALT（U/L）35.24±2.15154.18±8.33*55.62±4.35*△AST（U/L）51.39±3.87297.47±8.96*86.54±5.26*△FBG（mmol/L）5.38±0.455.52±0.475.46±0.42HOMA-IR 1.53±0.192.26±0.23*1.64±0.22△

表2 各組小鼠肝組織p62及通路蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組小鼠肝組織p62及通路蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；PI3K：磷脂酰肌醇-3-羥基激酶；p-AKt：磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶；p-mTOR：磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

組別正常對(duì)照組模型組觀察組只數(shù)151515p620.97±0.061.45±0.08*1.04±0.07△PI3K 0.87±0.051.52±0.06*0.96±0.07△p-AKt 0.85±0.051.64±0.08*0.94±0.08△p-mTOR 0.68±0.031.12±0.04*0.59±0.02△

自噬（autophagy）為真核生物特有的進(jìn)化上高度保守的分解代謝方式，廣泛參與機(jī)體的生理病理過(guò)程。研究[12]表明，自噬與NAFLD之間存在密切關(guān)系。研究[13-14]表明，自噬可降解肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴，進(jìn)而改善脂肪肝。自噬相關(guān)基因Atg5敲除的小鼠高脂飲食后肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量較正常鼠明顯增加。相反，自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可明顯降低肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量[15]。而且，自噬可通過(guò)線粒體自噬來(lái)吞噬降解損傷的線粒體，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激[16]。p62為公認(rèn)的自噬特異性底物及評(píng)價(jià)“自噬潮”的標(biāo)志物。自噬發(fā)生時(shí)，p62水平下降；而自噬受抑制后，p62水平上升[17]。研究[18]表明，p62蛋白能解除Beclin1與Bcl-2之間的結(jié)合，游離Beclin1從而促使自噬的發(fā)生。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）屬于進(jìn)化上較保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶之一，參與細(xì)胞發(fā)育、核糖體生成及代謝調(diào)控等生理過(guò)程，與糖尿病、心血管疾病及腫瘤疾病等多種疾病密切相關(guān)[19]。mTOR能負(fù)向調(diào)控細(xì)胞自噬體的形成，其活化程度能間接反映自噬水平。mTOR調(diào)控細(xì)胞自噬主要通過(guò)mTOR依賴性和非依賴性兩條信號(hào)通路發(fā)揮作用[20]。雷帕霉素可抑制mTOR活化，導(dǎo)致其下游p70S6激酶（S6kinase）活性降低，進(jìn)而促進(jìn)自噬發(fā)生[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇 3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）/mTOR信號(hào)通路在自噬中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，針對(duì)該信號(hào)通路的選擇性抑制劑在治療腫瘤方面已取得較為滿意的效果。

白藜蘆醇廣泛存在于如葡萄、花生及藜蘆等中，是一種天然的植物抗毒素，具有如抗氧化、抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)作用[23]。研究[24]發(fā)現(xiàn)，Res具有減輕肝細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，并改善肝臟功能。研究[25]顯示，Res可能通過(guò)下調(diào)肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ（PPARγ）、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮改善NAFLD的作用。研究[26]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能上調(diào)NAFLD大鼠肝內(nèi)AMP活化的蛋白激酶（AMPK）與沉默信息調(diào)節(jié)因子1（IRT1）表達(dá)，而下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）表達(dá)。目前針對(duì)NAFLD中Res對(duì)自噬影響的研究報(bào)道不多。

本研究顯示，Res干預(yù)可顯著改善脂代謝、IR和肝功能（P<0.05），與前期研究結(jié)果一致；同時(shí)，Res干預(yù)可顯著降低p62、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平（P<0.05），這表明Res可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而誘發(fā)自噬。由于本研究樣本例數(shù)和設(shè)計(jì)的局限，Res對(duì)自噬的促進(jìn)作用及其具體的mTOR信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，Res可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)自噬，最終發(fā)揮改善NAFLD的脂代謝、IR和肝功能的作用。

［1］C h a l a s a n i N，Y o u n o s s i Z，L a v i n eJ E，e t a l.T h ed i a g n o s i s and management of non-alcoholic fatty liver disease：practice guideline by the American Gastroenterological Association，American Association for the Study of Liver Diseases，and American College of Gastroenterology［J］.Gastroenterology，2012，107（6）：811.

［2］ L i Z，X u eJ，C h e nP，e t a l.P r e v a l e n c eo f n o n a l c o h o l i cf a t t y liver disease in mainland of China：a meta-analysis of published studies［J］.Journal of Gastroenterology&Hepatology，2014，29（1）：42-51.

［3］F u n g J，L e e C K，C h a nM，e t a l.1335h i g hp r e v a l e n c e o f nonalcoholic fatty liver disease in the chi－nese-results from the hong kong liver health census［J］.Journal of Hepatology，2015，35（2）：542-549.

［4］Wh i t e D L，K a n w a l F，E l-S e r a g H B.A s s o c i a t i o nB e t w e e nNonalcoholic Fatty Liver Disease and Risk for Hepatocellular Cancer，Based on Systematic Review［J］.Clinical Gastroenterology&Hepatology the Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association，2012，10（12）：1342-1359.

［5］ M u s s oG，G a m b i n oR，C a s s a d e r M，e t a l.M e t a-a n a l y s i s：natural history of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）and diagnostic accuracy of non-invasive tests for liver disease severity［J］.Annals of Medicine，2011，43（8）：617-649.

［6］陳光榆，范建高.中國(guó)脂肪性肝病流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2013，33（9）：738-741.

［7］任平，王文斌，歐陽(yáng)昌漢，等.白藜蘆醇對(duì)脂肪肝小鼠肝臟病理?yè)p傷的作用［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（16）：1339-1342.

［8］毛雨晴，樊曉明.自噬-非酒精性脂肪肝病的治療新靶向［J］.世界華人消化雜志，2015，23（32）：5107-5112.

［9］李曉沖，張秀英，徐尚，等.C 57B L/6J小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49（1）：6-8.

［10］范建高.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）［J］.中華肝臟病雜志，2010，4（3）：167-170.

［11］D a s S K，B a l a k r i s h n a nV.R o l e o f c y t o k i n e s i nt h e p a t h o g e nesis of non-alcoholic fatty liver disease［J］.Indian J Clin Biochem，2011，26（2）：202-209.

［12］ Y o u l eR J，N a r e n d r aD P.M e c h a n i s m so f m i t o p h a g y［J］.N a t Rev Mol Cell Biol，2011，12（1）：9-14.

［13］劉凱，徐樹(shù)瑩，徐斌，等.早期自噬在非酒精性脂肪肝中的保護(hù)作用［J］.北京醫(yī)學(xué)，2011，33（12）：947-949.

［14］L i uK，C z a j aM J.R e g u l a t i o no f l i p i ds t o r e sa n dm e t a b o l i s m by lipophagy［J］.Cell Death&Differentiation，2013，20（1）：3-11.

［15］L i nC W，Z h a n g H，L i M，e t a l.P h a r m a c o l o g i c a l P r o m o t i o no f Autophagy Alleviates Steatosis and Injury in Alcoholic and Non-alcoholic Fatty Liver Conditions in Mice［J］.Journal of H e p a t o l o g y，2013，58（5）：993-999.

［16］ Z h a n gY，Q i H，T a y l o rR，e t a l.T h er o l eo f a u t o p h a g yi n mitochondria maintenance：characterization of mitochondrial functions in autophagy-deficient S.cerevisiae strains［J］.Autophagy，2007，3（4）：337-346.

［17］I t a k u r a E，M i z u s h i m a N.p 62t a r g e t i n g t o t h e a u t o p h a g o some formation site requires self-oligomerization but not LC3binding［J］.Journal of Cell Biology，2011，192（1）：17-27.

［18］Z h o uL，Wa n g H F，R e nH G，e t a l.B c l-2d e p e n d e n t u p r e g ulation of autophagy by sequestosome 1/p62in vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2013，34（5）：651-656.

［19］G a n gW，X i eW，L i uZ，e t a l.H y p o x i a-i n d u c e dM I R 155i s a potent autophagy inducer by targeting multiple players in the MTOR pathway［J］.Autophagy，2014，10（1）：70-79.

［20］J u n gC H，R oS H，C a oJ，e ta l.m T O R r e g u l a t i o no fa utophagy［J］.Febs Letters，2010，584（7）：1287.

［21］錢(qián)帥偉，漆正堂，丁樹(shù)哲.哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通路與細(xì)胞自噬［J］.生命科學(xué)，2011，23（8）：730-735.

［22］李樂(lè)興，戴漢川.細(xì)胞自噬調(diào)控的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37（2）：263-270.

［23］安梅，周瑾，陳曉宇.白藜蘆醇藥理學(xué)作用的研究進(jìn)展［J］.腫瘤藥學(xué)，2014，4（4）：242-246.

［24］黃英，李雪蘭，蔣鳳榮.白藜蘆醇對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠的作用機(jī)制研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（4）：366-368.

［25］劉愛(ài)林，陳璐璐，張皎月，等.白藜蘆醇對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)影響的研究［J］.中國(guó)糖尿病雜志，2012，20（8）：622-624.

［26］高燕翔，張勇，劉裕，等.S R E B P-1c在白藜蘆醇預(yù)防大鼠非酒精性脂肪肝發(fā)生中的作用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37（17）：1704-1708.