崔秀雲(yún) 孫寧寧 謝小娜 孫萬春 趙晴 劉寧

摘 要 以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）為模型體系，建立了非天然氨基酸代謝摻入法檢測特定新生成蛋白的方法。通過代謝摻入的方法，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，特別是新生成的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中摻入非天然氨基酸，即帶有疊氮基團(tuán)的甲硫氨酸類似物（Azidohomoalanine，AHA）?？疾炝嗽诓煌瑵舛鹊腖PS和FBS，以及不同的刺激時間等條件下，LPS刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的實驗參數(shù)，確定了最優(yōu)的實驗條件為： 在含有1%胎牛血清的無甲硫氨酸（Met）的DMEM培養(yǎng)基中，分別在不加LPS和加10 ng/mL的LPS條件下刺激Raw264.7細(xì)胞4 h，在刺激細(xì)胞的同時摻入AHA。利用Cu+催化的疊氮基團(tuán)與帶有生物素（Biotin）標(biāo)簽的炔烴基團(tuán)的環(huán)加成反應(yīng)，使蛋白質(zhì)標(biāo)記上Biotin標(biāo)簽。利用吸附在固相載體上的抗體特異性捕獲TNF-α分子，再用耦聯(lián)辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）的鏈霉親和素（Streptavidin）對TNF-α分子上的Biotin進(jìn)行識別，實現(xiàn)對特定的新生成蛋白質(zhì)（TNF-α）進(jìn)行檢測。本方法為檢測特定微量新生成蛋白、表征特定蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)等研究提供了新的思路法。

關(guān)鍵詞 新生成蛋白；非天然氨基酸；腫瘤壞死因子α；點(diǎn)擊化學(xué)

1 引 言

蛋白質(zhì)是細(xì)胞中最主要的組成部分，幾乎參與所有的生命過程。正常以及病理狀態(tài)的細(xì)胞，都會通過蛋白質(zhì)的合成與降解、翻譯后修飾等維持正常細(xì)胞生理狀態(tài)及快速適應(yīng)環(huán)境變化[1]。因此，對蛋白質(zhì)進(jìn)行活體標(biāo)記，進(jìn)而研究新生成蛋白質(zhì)、表征蛋白質(zhì)的代謝狀況具有重要意義[2，3]。

通過代謝摻入方式，可以利用非天然氨基酸對新生成的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。非天然氨基酸是指自然界不存在的、由人工合成的氨基酸，例如帶有疊氮基團(tuán)的甲硫氨酸類似物（Azidohomoalanine，AHA），它可以在細(xì)胞的正常蛋白質(zhì)合成過程之中摻入到蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中，在細(xì)胞中無偏愛性，無毒性，也不會引起蛋白的降解[4，5]。當(dāng)非天然氨基酸成功摻入細(xì)胞后，利用Cu+催化的疊氮與炔基的環(huán)加成反應(yīng)（Copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition， CuAAC）[6]，使細(xì)胞中新生成的蛋白質(zhì)標(biāo)記上生物素（Biotin）等標(biāo)簽，進(jìn)而富集，并利用質(zhì)譜技術(shù)對新生成蛋白進(jìn)行鑒定[7，8]；或者將新生成的蛋白質(zhì)標(biāo)記上熒光分子，從而可以利用影像學(xué)技術(shù)對新生成蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)進(jìn)行直接觀察[9，10]。

目前，該領(lǐng)域大多數(shù)的工作集中在對特定條件下的新生成蛋白進(jìn)行整體的組學(xué)研究，即所研究的對象和目標(biāo)分子為一組蛋白質(zhì)混合物（蛋白質(zhì)組）[7～10]。而對特定目標(biāo)蛋白分子的新生成情況尚沒有較為成熟的分析方法。本研究將抗體-抗原反應(yīng)的特異性與代謝標(biāo)記方法有機(jī)地結(jié)合，首先，將非天然氨基酸AHA通過細(xì)胞自身的蛋白質(zhì)合成機(jī)制摻入到蛋白質(zhì)中，使新生成蛋白質(zhì)上攜帶上Biotin標(biāo)簽；再利用抗體將特定目標(biāo)蛋白分子特異性捕獲，采用耦聯(lián)辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）的鏈霉親和素對目標(biāo)蛋白分子上的Biotin進(jìn)行識別，達(dá)到對特定的新生成蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測的目的。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ELx50洗板機(jī)（美國BioTek公司）；Tecan SUNRISE酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國 Thermo 公司）；96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板（美國Costar公司）；AllegraTMX-22R Centrifuge離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；Tanon6200 化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon公司）。

不含甲硫氨酸（Met）的DMEM培養(yǎng)基（DMEM（-），Gibco公司）；胎牛血清（FBS， Hyclone公司）；青霉素和鏈霉素混合物（PS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（康寧公司）；Azidohomoalanine（AHA， 美國AnaSpec公司）；BIOTIN alkyne（美國Lumiprobe公司）；Tris（3-hydroxypropyltriazolylmethyl）amine（THPTA， 美國Clickchemistrytools公司）；Lipopolysaccharide（LPS）、Met（≥99.5%，）、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（Carbonated-bicarbonate），CuSO4（≥99.99%）（美國Sigma-Aldrich公司）；蛋白酶抑制劑（Roche 公司）；核酸酶（美國GE Healthcare 公司）；抗壞血酸鈉（美國ACROS Organics 公司）；生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶（Biotin-HRP， 美國Thermo Scientific公司）；鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶（SA-HRP， 美國Invitrogen 公司）；抗腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor α， TNF-α）抗體、生物素-抗TNF-α抗體、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品、TMB 底物（美國Bioscience公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（美國Thermo Scientific公司）；Raw264.7細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。

2.2 Raw264.7細(xì)胞的培養(yǎng)、非天然氨基酸摻入及LPS刺激實驗

將Raw264.7細(xì)胞在含有10% FBS和1% PS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，將細(xì)胞鋪到24孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，以恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)。次日，棄掉24孔板中的培養(yǎng)基，用提前預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞，然后用DMEM（-）培養(yǎng)基在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1 h。棄掉24孔板中的培養(yǎng)基，用含有不同濃度LPS的DMEM（-）培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，同時摻入4 mmol/L AHA或Met，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h或6 h。

2.3 蛋白質(zhì)提取及點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)

棄去培養(yǎng)基后，用PBS清洗細(xì)胞3次，再用細(xì)胞刮子收集細(xì)胞至新的離心管中，以500 g離心10 min。 棄上清液，用PBS（含1% SDS）裂解細(xì)胞，并加入適量蛋白酶抑制劑和核酸酶。然后將細(xì)胞裂解液煮沸10 min，離心，收集上清液。用PBS稀釋10倍后，向樣品中加入適量THPTA、抗壞血酸鈉、CuSO4、Biotin alkyne。高速渦旋混勻后，4℃避光反應(yīng)過夜[6]。

2.4 ELISA法測定TNF-α

用0.05 mol/L碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH 9.6）將抗TNF-α抗體稀釋1000倍，加入 96孔板中，每孔100 μL，4℃孵育過夜。棄去孔中的液體后，用含有0.5% Tween-20的PBS（PBST）清洗3次。用含有0.5% BSA和0.1% Tween-20的PBS封閉，室溫孵育1 h。經(jīng)清洗后，每孔加入100 μL樣品，37℃孵育2 h。棄去上清液，經(jīng)清洗后，加入適量稀釋的生物素-抗TNF-α抗體，37℃孵育1.5 h。用PBST清洗96孔板3次，每孔加入100 μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的SA-HRP，37℃孵育1 h。充分清洗96孔板后，每孔加入100 μL TMB底物反應(yīng)液，37℃避光孵育20 min。每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀上測定450 nm處各孔吸光度。以系列梯度稀釋的TNF-α為標(biāo)準(zhǔn)品，在上述同樣條件下測定，以TNF-α各孔吸光度對其濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 Western blot檢測

將樣品與SDS上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，冷卻至室溫，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用濕轉(zhuǎn)方法，冰浴條件下將凝膠上的樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后，先用含有5% BSA的TBST（50 mmol/L Tris-HCl （pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20）將膜在室溫孵育2 h。清洗后，用適量稀釋的一抗或HRP與膜在4℃孵育過夜。與經(jīng)適量稀釋的二抗在室溫條件下孵育2 h后，用TBST清洗，經(jīng)化學(xué)發(fā)光（CL）成像后分析結(jié)果。經(jīng)SA-HRP孵育過夜的膜，用TBST清洗后，直接采用CL成像，分析結(jié)果。

2.6 標(biāo)記Biotin的TNF-α的檢測

抗體在96孔板上的包被、封閉、清洗及上樣等步驟與2.4 節(jié)中的步驟一致，待加完樣品于37℃孵育2 h后，棄去上清液，經(jīng)清洗，加入適量稀釋的SA-HRP，37℃孵育1 h。充分清洗96孔板后，每孔加入100 μL TMB底物反應(yīng)液，37℃孵育20 min。每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔吸收值。同時，以系列梯度稀釋（8×105、1.6×106、3.2×106、6.4×106和1.28×107倍稀釋）的Biotin-HRP（1 mg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)品，直接包被，經(jīng)封閉、清洗后，利用SA-HRP測定各孔450 nm處吸光度，以Biotin的濃度對吸光度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗參數(shù)優(yōu)化及方法建立

Raw264.7細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞，在藥物開發(fā)、免疫機(jī)理、信號通路等研究中應(yīng)用廣泛。Raw264.7細(xì)胞易于培養(yǎng)，且當(dāng)細(xì)胞在外界刺激（病原體入侵或者藥物刺激）下，能夠分泌多種細(xì)胞因子，如白介素-1β、白介素-6、TNF-α等[11～13]。本研究以LPS刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α[14～16]為體系，對實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，首先考察了LPS濃度、LPS的處理時間對實驗結(jié)果的影響。由于AHA與Met相互競爭摻入蛋白分子，為了最大程度提高AHA代謝摻入的效率，必須盡量減少培養(yǎng)基中所含有的Met。因此，本研究共使用了3種不同的培養(yǎng)基，分別為不含Met的DMEM培養(yǎng)基（DMEM（-））、含Met 的DMEM培養(yǎng)基（DMEM（+））、含AHA的DMEM培養(yǎng)基（DMEM（*））。初步研究結(jié)果表明，LPS刺激Raw264.7的最佳時間是6 h， 能夠產(chǎn)生最大濃度的TNF-α。而通常利用AHA代謝摻入的時間在2～4 h時，已經(jīng)足以檢測到標(biāo)記蛋白產(chǎn)物，而摻入時間過長有可能會對細(xì)胞的正常生理過程產(chǎn)生影響，因此在不添加FBS的情況下，分別用DMEM（-）、DMEM（+）和DMEM（*）培養(yǎng)Raw264.7細(xì)胞，同時加入不同濃度的LPS，分別培養(yǎng)4 h和6 h后，收集上清液，ELISA法檢測上清液中的TNF-α濃度。

如圖1所示，當(dāng)用DMEM（-）培養(yǎng)基時，LPS刺激細(xì)胞后所產(chǎn)生的TNF-α濃度都比較低，且刺激6 h所產(chǎn)生的TNF-α濃度比刺激4 h所產(chǎn)生的TNF-α濃度低，說明培養(yǎng)基中不含有Met或者M(jìn)et類似物時，對細(xì)胞的生理活性影響很大，且時間越長，影響越大。當(dāng)摻入Met時，LPS刺激細(xì)胞4 h和6 h所產(chǎn)生的TNF-α濃度很高，且趨勢相似，說明摻入Met的DMEM培養(yǎng)基對細(xì)胞的生理活性影響很小，且不隨時間長短發(fā)生變化。當(dāng)摻入AHA時，LPS刺激細(xì)胞所產(chǎn)生的TNF-α濃度也比較低，且刺激6 h所產(chǎn)生的TNF-α濃度低于刺激4 h所產(chǎn)生的TNF-α濃度，說明AHA對細(xì)胞的生理活性有一定的影響，且時間越長，影響越大。因此，本研究選擇LPS刺激的時間為4 h。

考察了LPS在1% FBS時刺激Raw264.7細(xì)胞4 h所產(chǎn)生的TNF-α濃度。當(dāng)DMEM（-）培養(yǎng)基中含有1%血清時，用不同濃度的LPS刺激Raw-264.7細(xì)胞4 h，同時摻入Met或AHA。收集上清液，ELISA法檢測上清液中的TNF-α濃度，結(jié)果如表1所示。當(dāng)不加LPS時，細(xì)胞所產(chǎn)生的TNF-α本底濃度很低，隨LPS濃度升高，TNF-α濃度顯著升高；當(dāng)LPS濃度高于10 ng/mL時，摻入AHA的細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后所產(chǎn)生的TNF-α濃度有所下降。綜合以上結(jié)果，確定最優(yōu)的實驗條件為： 在含有1%胎牛血清DMEM（-）培養(yǎng)基中，分別在不加LPS和加10 ng/mL的LPS條件下刺激Raw264.7細(xì)胞4 h，在刺激細(xì)胞的同時摻入AHA。

3.2 在LPS刺激下Raw264.7細(xì)胞新生成蛋白質(zhì)的檢測

在24孔板里對所選取的4組樣品進(jìn)行細(xì)胞裂解，將所得的細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，離心后收集上清液，吸取600 μL進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，使新生成的蛋白質(zhì)被標(biāo)記上生物素。

將樣品用0.05 mol/L碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋到合適濃度后，4℃孵育過夜。利用生物素與親和素之間的相互作用，使SA-HRP對新生成蛋白質(zhì)上連接的Biotin進(jìn)行識別，從而間接地指示新生成蛋白質(zhì)的濃度（以Biotin濃度表示，圖2A）。同時，用Western blot法對所得結(jié)果進(jìn)行驗證（圖2B）。摻入AHA的兩組樣品，測得的Biotin濃度明顯高于摻入Met的兩組樣品測得的Biotin濃度。Western blot結(jié)果表明，摻入AHA的兩組樣品通過HRP檢測的結(jié)果為陽性，而摻入Met的兩組樣品的結(jié)果為陰性， 說明細(xì)胞中成功地?fù)饺肓薃HA，且新生成蛋白質(zhì)上成功地標(biāo)記上了Biotin。然而，天然氨基酸Met分子由于沒有疊氮基團(tuán)，無法與Biotin-alkyne發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，因此新生成蛋白質(zhì)無法標(biāo)記上生物素。由圖2可見，在摻入AHA的兩組樣品中，4號樣品中的Biotin標(biāo)記蛋白信號高于3號樣品，說明細(xì)胞在LPS刺激下有更多的AHA分子被摻入到蛋白質(zhì)中，產(chǎn)生了更多的新生成蛋白。

3.3 Raw264.7細(xì)胞在LPS刺激下新生成TNF-α蛋白的檢測

利用抗體-抗原反應(yīng)的特異性，用抗TNF-α抗體特異性捕獲細(xì)胞裂解液中的TNF-α，再用SA-HRP對TNF-α上連接的Biotin進(jìn)行識別，從而間接地反映新生成TNF-α的濃度（以Biotin濃度表示，圖3B）；同時，以系列梯度稀釋的Biotin-HRP為標(biāo)準(zhǔn)品，利用SA-HRP測定各孔在450 nm的吸光度，以Biotin的濃度對吸光度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3A）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，分別得出4組樣品中TNF-α的相對含量，發(fā)現(xiàn)LPS濃度為10 ng/mL時刺激細(xì)胞4 h后新生成的TNF-α的相對量為28.37 pmol/L。當(dāng)LPS摻入濃度為0時，測得的新生成TNF-α濃度為12.11 pmol/L，高于摻入Met的兩組，可能是因為AHA摻入時間較長，刺激細(xì)胞產(chǎn)生了額外的TNF-α。

4 結(jié) 論

以LPS刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α為體系，通過代謝摻入AHA ，并利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，使細(xì)胞中新生成的蛋白質(zhì)標(biāo)記上生物素標(biāo)簽。再利用吸附在固相載體上的抗體將TNF-α分子特異性捕獲，達(dá)到對特定的新生成蛋白質(zhì)（TNF-α）進(jìn)行檢測的目的。本研究為檢測特定微量新生成蛋白、表征特定蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)等方面提供了可借鑒的方法。

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