陳興銀，彭昌琴，陸贈(zèng)玉，楊 鵬，關(guān) 萍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

刺梨(RoseroxburghiiTratt)，又名送春歸、文先果，薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木[1]。原產(chǎn)于云貴高原。主要分布貴州、四川、重慶等地[2]。前人研究報(bào)道，刺梨的抗氧化、防癌、抗輻射、消炎等藥理作用具有極高的醫(yī)療價(jià)值。刺梨中含有豐富Vc、多種人體必需氨基酸、黃酮、多糖等物質(zhì)，具有進(jìn)一步加工成品的價(jià)值，尤其因果實(shí)富含Vc而備受國內(nèi)外關(guān)注，同時(shí)還具有觀賞價(jià)值[3-5]。ISSR是Zietkiewicz在1994年所建立的一種分子標(biāo)記技術(shù)[6]。ISSR同時(shí)具備RAPD、SSR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，且具有操作簡單、多態(tài)性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前ISSR已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性及植物系統(tǒng)演化、分類等研究[7]。鄢秀芹等對(duì)刺梨轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析[8]。文曉鵬等利用RAPD、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同自然分布區(qū)刺梨的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明來自貴州的刺梨遺傳多樣性最為豐富[9，10]。基于貴州地區(qū)刺梨遺傳多樣性豐富進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)貴州不同地區(qū)野生刺梨及近緣種無籽刺梨親緣關(guān)系近分析。為進(jìn)一步對(duì)刺梨親緣關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于ISSR分子標(biāo)記的14份樣品，13份都來自于貴州不同地區(qū)，及一份來自于重慶的(表1)。各樣品均采集新鮮葉片作為材料，采集后立即用硅膠干燥、保存?zhèn)溆?。其?中樣品所對(duì)應(yīng)的序號(hào)也是個(gè)樣品的代號(hào)。

表1 研究所用材料名稱、來源Tab.1 List of materials used in the study

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1基因組總DNA的提取 取新鮮葉片放于冰盒中，帶回-20℃保存?zhèn)溆?，植物DNA采用天根公司植物DNA提取試劑盒提取。DNA提取后，1%瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量和濃度，DNA濃度稀釋至20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的合成與篩選 ISSR引物的合成根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of BritisHColumbia，UBC)公布的引物序列(http： / /www.biotech.ubc.ca /services / naps / primers.html)，由昆明碩擎有限公司合成，共50條，從中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性較好的13條引物用于刺梨與無籽刺梨資源遺傳多樣性擴(kuò)增分析。

1.2.3ISSR反應(yīng)體系及程序 ISSR反應(yīng)體系為：25 μL反應(yīng)體系，1 μLDNA模板，1 μL引物，12.5 μLMix，Mix和分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000的Maker購于昆明碩擎有限公司，其余用ddH2O補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序參照楊帆等(2011)[11]：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性15 s，58℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，57℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，56℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，55℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，54℃退火35 s，72℃延伸90 s，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94℃變性15 s，53℃退火35 s，72℃延伸90 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，結(jié)束后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物4℃保存。取5 μL在2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳1 h左右，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按條帶的有無分別統(tǒng)計(jì)條帶。有條帶記為1，無條帶記為0，把得到的0，1分布矩陣從Excel 2003中導(dǎo)入軟件NTsys 2.10e中，用SM法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)用50條引物對(duì)14份材料基因組DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增篩選引物，ISSR擴(kuò)增結(jié)果見表2。13條引物對(duì)14份樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出162條DNA條帶，其中150條為多態(tài)性條帶。擴(kuò)增出來引物的條帶數(shù)在4～22之間，平均為12.5條，多態(tài)百分率為92.54%，有10條引物擴(kuò)增的多態(tài)性百分率為100%。其中UBC881擴(kuò)增出來的條帶最多(22條)，圖1是引物UBC881 ISSR擴(kuò)增出來的結(jié)果。

表2 ISSR引物序列及擴(kuò)增多態(tài)性百分比Tab.2 ISSR primer sequences and I percentage of amplified polymorphism

圖1 UBC881引物的電泳結(jié)果 M.DL2000 maker

2.2 樣品遺傳相似系數(shù)的ISSR分析

13對(duì)引物組合擴(kuò)增得到162條帶，用NTsys2.10e軟件計(jì)算各個(gè)樣品間的遺傳相似性系數(shù)，表3。由表3可知，來自貴州不同地區(qū)的14個(gè)野生樣品，其相互間的相似系數(shù)為0.50～0.85。相似系數(shù)最大樣品組合有兩個(gè)，分別是來自安順關(guān)嶺縣與六盤水的刺梨、貴陽息烽與六盤水的刺梨，相似系數(shù)均為0.85。相似系數(shù)最小樣品組合為來自黔西南興仁的刺梨與貴陽植物園無籽刺梨，相似系數(shù)為0.50。相似系數(shù)在0.8及以上的組合有8個(gè)，分別為來自貴陽燕樓鄉(xiāng)與安順關(guān)嶺縣、畢節(jié)七星關(guān)區(qū)與貴陽息烽的刺梨，相似系數(shù)均為0.83。來自畢節(jié)七星關(guān)區(qū)分別與安順關(guān)嶺縣、六盤水的刺梨組合，相似系數(shù)均為0.82。來自安順關(guān)嶺縣分別與貴陽花溪、貴陽息烽的刺梨組合，相似系數(shù)均為0.80。刺梨與無籽刺梨之間相似系數(shù)為0.50～0.67。來自貴陽植物園無籽刺梨分別與六盤水、黔西南興仁的刺梨組合，相似系數(shù)分別為0.67、0.50。無籽刺梨互相間的相似系數(shù)為0.56～0.78。來自貴陽植物園與黔西南興仁的野生無籽刺梨、來自安順光枝無籽刺梨組合相似系數(shù)分別為0.56、0.67。來自安順光枝無籽刺梨與黔西南興仁的野生無籽刺梨相似系數(shù)為0.78。刺梨間相互的相似系數(shù)為0.55～0.85。

2.3 樣品UPGMA聚類結(jié)果分析

由圖2可看出，來自銅仁梵凈山、貴陽燕樓鄉(xiāng)、安順關(guān)嶺縣、六盤水、畢節(jié)七星關(guān)區(qū)、貴陽息烽的刺梨聚為一支，且來自安順關(guān)嶺縣刺梨與六盤水刺梨相距最近，親緣關(guān)系最近。來自重慶開縣的刺梨單獨(dú)聚為一支。來自遵義桐梓、貴陽花溪、遵義道真縣的刺梨聚為一支，來自貴陽花溪刺梨與遵義道真縣的刺梨親緣關(guān)系較近。安順，光枝無籽刺梨與黔西南興仁野生無籽刺梨聚為一支，來自黔西南興仁的刺梨與貴陽植物園無籽刺梨單獨(dú)聚為一支。

表3 11份野生刺梨和無籽刺梨資源的遺傳相似系數(shù)Tab.3 Genetic similarity coefficients of R. roxburghii and R. sterilis material

圖2 11份刺梨和3份無籽刺梨植物材料的UPGMA聚類樹狀圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 11 R. roxburghii and 3 R. sterilis

3 討 論

在親緣關(guān)系上，相似系數(shù)越大，親緣關(guān)系也越近。ISSR分析結(jié)果顯示，同屬遵義市桐梓縣和道真縣的刺梨，遵義道真縣與貴陽花溪親緣關(guān)系比與遵義桐梓的近。同屬花溪區(qū)的刺梨，貴陽花溪燕樓鄉(xiāng)與貴陽息烽縣的親緣關(guān)系比與貴陽花溪大。貴州關(guān)嶺縣和貴州六盤水相似系數(shù)最大(0.85)，親緣關(guān)系最近。說明刺梨間的親緣關(guān)系與地理分布沒有相關(guān)性。此結(jié)果與文曉鵬對(duì)30份不同地方野生刺梨多樣性分析的相一致。2009年，安明態(tài)等發(fā)現(xiàn)貴州薔薇屬的一個(gè)新變種，發(fā)布新種為光枝無籽刺梨[12]。表2中不同地方的野生刺梨的遺傳相無籽刺梨間相似系數(shù)為0.56～0.78，組合為黔西南興仁野生無籽刺梨和安順光枝無籽刺梨的相似系數(shù)最大為0.78，其數(shù)值處于刺梨相互間遺傳系數(shù)0.55～0.85間，且大于刺梨與無籽刺梨相互間的最大相似系數(shù)0.67。據(jù)此可認(rèn)為來自黔西南野生興仁無籽刺梨和安順光枝無籽刺梨是同一個(gè)種。其結(jié)果與李旦等利用AFLP分子標(biāo)記和DNA條形碼對(duì)無籽刺梨鑒定中得到興仁無籽刺梨與安順光枝無籽刺梨為同一種的結(jié)果相一致[13]。

[1] 董李娜， 潘蘇華.刺梨的研究進(jìn)展田[J]. 江蘇中醫(yī)藥， 2007， 39(8)：78- 79.

[2] 杜文義.綠色保健果刺梨[J]. 新農(nóng)村， 2007， (6)：14.

[3] 涂國云， 劉利花.刺梨的營養(yǎng)成份及保健藥用[J]. 中國林副特產(chǎn)， 2006， (1)：68- 70.

[4] 唐 星.刺梨珍珠飲料中維生素C和超氧化物歧化酶(SOD)穩(wěn)定性的研究田.飲料工業(yè)， 2004， 7 (5)：17-19.

[5] 陳 軍.小同浸提條件對(duì)刺梨Vc提取的影響[J]. 廣西輕工業(yè)，2004(4)： 17.

[6] Ziekienlcz E， Rafashl A.Labuda D.Genome fingerprinting by Simple Sequence repeats(SSR) anchored polymerase chain reaction amPlification[J].Genomics， 1994， 20：176-183.

[7] 李 帆.藍(lán)花楹種子萌發(fā)與幼苗生長特性研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

[8] 鄢秀芹， 魯 敏， 安華明.刺梨轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析及其分子標(biāo)記開發(fā)[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2015， 42(2)：341-349.

[9] 文曉鵬， 龐曉明， 鄧秀新.不同自然分布區(qū)刺梨遺傳多樣的RAPD分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科， 2003， 36(7)： 823-828.

[10] Wen X P， Pang X M， Deng X X.Characterization of genetic relationships of Rosa roxburghii Tratt and its relatives using morphological traits，RAPD and AFLP markers[J].JouralofHorticulturalScienceandBiotechnology， 2004(79)：189-196.

[11] 楊 帆，曾 麗，葉 康，等.17份薔薇屬植物的親緣關(guān)系形態(tài)學(xué)ISSR分析[J]. 植物研究，2011，31(2)：193-198.

[12] 安明態(tài).貴州薔薇屬一新變種—光枝無籽刺梨[J]. 資源與利用，63.

[13] 李 旦， 周安佩， 張德國， 等.基于AFLP分子標(biāo)記和DNA條形碼對(duì)無籽刺梨的鑒定[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2015， 28(1)： 116-121.