劉 銳，李 茂，謝博君，潘 勤

[1.天津市中藥質(zhì)量控制(企業(yè))重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中新藥業(yè)研究中心，天津 300457； 2.天津市醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，天津 300204]

合歡花為豆科植物合歡(AlbiziajulibrissinDurazz)的干燥花序。合歡花為傳統(tǒng)養(yǎng)心安神藥，用于心神不安、憂郁失眠等癥。現(xiàn)代藥理研究表明，合歡花水煎液有明顯的鎮(zhèn)靜催眠及抗抑郁活性[1-4]，但是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。文獻(xiàn)報(bào)道合歡花所含化學(xué)成分主要是黃酮類、酚酸類、單萜類及木脂素類化合物[5-9]。榮光慶[9]研究表明合歡花的大極性部位對(duì)四個(gè)與催眠相關(guān)的受體5-HT1A、5-HT2C、MT1和MT2具有一定激動(dòng)活性，通過HPLC-MS分析活性部位，推測(cè)其中主要為三萜皂苷類成分。韓國學(xué)者[10]研究表明，從合歡花中分離得到的槲皮苷和異槲皮苷能延長閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間。為了進(jìn)一步明確合歡花鎮(zhèn)靜催眠的活性成分，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，本課題組對(duì)合歡花各處理部位進(jìn)行初步藥效篩選，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取部位和大孔樹脂柱70%洗脫部位能協(xié)同最大閾下劑量戊巴比妥鈉增加小鼠入睡率，顯著延長小鼠睡眠時(shí)間。從這兩個(gè)活性部位中進(jìn)一步分離得到10個(gè)化合物，通過波譜技術(shù)鑒定了化合物結(jié)構(gòu)，分別為山柰酚(1)、槲皮素(2)、3, 4-二羥基苯甲酸(3)、3, 7-dimethyloct-1-en-3, 6, 7-triol(4)、α-波甾醇3-O-β-D-葡萄糖苷(5)、山柰酚3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(6)、槲皮素3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(7)、julibroside A3(8)、adianthifolioside A(9)和julibroside Ⅲ(10)。其中單萜化合物4為首次從合歡屬中分離得到，三萜皂苷化合物9、10為首次從合歡花中分離得到。

1 儀器與試藥

Bruker AV-400核磁共振儀(瑞士Bruker公司)，Quattro microTMAPI 質(zhì)譜儀(Waters公司)，Autoflex Ⅲ型質(zhì)譜儀(瑞士Bruker公司)，大孔樹脂(天津南開大學(xué)化工廠，D101型)，凝膠SephadexTMLH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，反相ODS硅膠(日本YMC公司)，柱色譜用硅膠和硅膠板購自青島海洋化工廠。乙腈(色譜純，購自honeywell公司)；其他試劑均為市售分析純。合歡花購自天津市中藥飲片廠有限公司，批號(hào)1404093，由天津市藥材集團(tuán)公司高級(jí)工程師元英群鑒定為豆科合歡屬植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz的干燥花序，標(biāo)本(No.201484)保存于天津中新藥業(yè)研究中心。

2 提取分離

合歡花5.5 kg用10倍量95%乙醇回流提取2次，殘?jiān)儆?0倍量70%乙醇回流提取1次。3次提取液合并濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。剩余的水部位用大孔樹脂柱層析，依次用水、30%乙醇、70%乙醇和95%乙醇梯度洗脫。以上幾個(gè)部位濃縮干燥后初步進(jìn)行鎮(zhèn)靜催眠活性篩選，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取部位及大孔樹脂柱70%乙醇洗脫部位活性較好，則重點(diǎn)分離這兩個(gè)部位。乙酸乙酯萃取部位(75 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜層析，石油醚-丙酮(10∶1～1∶1)，二氯甲烷-丙酮(1∶1)梯度洗脫得到5個(gè)流份(Fr. B1 ～ Fr. B5)。Fr. B4(18 g)再次經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-丙酮(10∶1 ～ 1∶1)梯度洗脫，并經(jīng)凝膠和反相柱色譜純化，得化合物1(30 mg)、2(700 mg)、3(200 mg)和4(1.2 g)。Fr. B5(29 g)放置過程中有白色固體析出，過濾得化合物5(400 mg)。母液濃縮干，取一半量用反相硅膠柱色譜分離，以乙醇-水(20∶80～35∶65)梯度洗脫，得到化合物6(1.5 g)和7(0.4 g)。大孔樹脂70%洗脫部位(118 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜層析，二氯甲烷-甲醇-水(5∶1∶0 ～ 1∶1∶0.3)梯度洗脫得到8個(gè)流分(Fr. E1～Fr. E8)，其中Fr. E5(5 g)先用凝膠柱色譜純化，再經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，以乙醇-水(40∶60～60∶40)梯度洗脫，得到化合物8(30 mg)。Fr. E7(20 g)用凝膠柱色譜純化脫色，經(jīng)兩次反相硅膠柱色譜層析，分別用甲醇-水(60∶40～75∶25)以及乙腈-水(33∶67～40∶60)梯度洗脫，最后用制備HPLC分離，以乙腈-水(含0.2%甲酸)(32∶68)洗脫得到化合物9(13 mg)。Fr. E8(15 g)先用凝膠柱色譜脫色，再經(jīng)反相硅膠柱色譜層析，用甲醇-水(70∶30～80∶20)梯度洗脫，最后用制備HPLC分離，以乙腈-水(含0.2%甲酸)(38∶62)洗脫得到化合物10(17 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

3.1化合物1 黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z285 [M - H]-。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ：12.48 (1H, s, 5-OH)，10.75 (1H, s, 7-OH)，10.11 (1H, s, 4′-OH)，9.36 (1H, s, 3-OH)，8.05 (2H, d,J=8.8 Hz, H-2′, 6′)，6.94 (2H, d,J=8.8 Hz, H-3′, 5′)，6.45 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8)，6.20 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ：175.9 (C-4)，163.9 (C-7)，160.7 (C-5)，159.2 (C-4′)，156.2 (C-2)，146.8 (C-9)，135.6 (C-3)，129.5 (C-2′, 6′)，121.7 (C-1′)，115.4 (C-3′, 5′)，103.0 (C-10)，98.2 (C-6)，93.5 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，鑒定化合物1為山柰酚。

3.2化合物2 黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z301 [M - H]-。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ：12.49 (1H, s, 5-OH)，10.76 (1H, s, 7-OH)，9.56 (1H, s, 4′-OH)，9.32 (1H, s, 3-OH)，9.28 (1H, s, 3′-OH)，7.69 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′)，7.54 (1H, dd,J=2.0, 8.4 Hz, H-6′)，6.89 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5′)，6.42 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8)，6.20 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ：175.8 (C-4)，163.9 (C-7)，160.7 (C-5)，156.1 (C-9)，147.7 (C-2)，146.8 (C-4′)，145.0 (C-3′)，135.7 (C-3)，121.9 (C-1′)，120.0 (C-6′)，115.6 (C-2′)，115.1 (C-5′)，103.0 (C-10)，98.2 (C-6)，93.3 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，鑒定化合物2為槲皮素。

3.3化合物3 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z153 [M - H]-。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ：7.43 (1H, d,J=8.0 Hz, H-6)，7.42 (1H, s, H-2)，6.80 (1H, d,J=8.0 Hz, H-5)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ：170.2 (COOH)，151.5 (C-4)，146.0 (C-3)，123.9 (C-6)，123.1 (C-1)，117.7 (C-2)，115.7 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，鑒定化合物3為3, 4-二羥基苯甲酸。

3.4化合物4 無色油狀物(甲醇)，ESI-MSm/z187 [M - H]-。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ：5.91 (1H, dd,J=10.8, 17.2 Hz, H-2)，5.19 (1H, d,J=17.2 Hz, H-1a)，5.02 (1H, d,J=10.8 Hz, H-1b)，3.21 (1H, dd,J=10.8, 1.28 Hz, H-6),1.85 (1H, dt,J=4.4, 12.8 Hz, H-4a)，1.50 (1H, dt,J=4.4, 12.8 Hz, H-4b)，1.67 (1H, m, H-5a)，1.30 (1H, m, H-5b)，1.13 (3H, s, H-8)，1.15 (3H, s, H-9)，1.26 (3H, s, H-10)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ：146.3 (C-2)，112.0(C-1)，80.1 (C-6)，73.9×2 (C-3, C-7)，40.8(C-4)，28.0 (C-10)，26.8 (C-5)，25.5 (C-9)，25.1 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，鑒定化合物4為3, 7-dimethyloct-1-en-3, 6, 7-triol。

3.5 化合物5 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z573 [M - H]-。1H-NMR (pyridine-d5, 400 MHz) δ：0.59 (3H, s, H-18)，0.73 (3H, s, H-19)，0.85 (3H, d,J=4.8 Hz, H-26)，0.87 (3H, d,J=4.8 Hz, H-27)，1.08 (3H, d,J=6.4 Hz, H-21)，5.04 (1H, d,J=7.6 Hz, H-7)，5.06 (1H, dd,J=8.8, 15.2 Hz, H-22)，5.20 (1H, dd,J=8.8, 15.2 Hz, H-23)。13C-NMR (pyridine-d5, 100 MHz) δ：139.5 (C-8)，138.6 (C-22)，129.6 (C-23)，117.8 (C-7)，102.2 (C-Glc-1)，78.6 (C-Glc-5)，78.5(C-Glc-3)，77.0 (C-3)，75.3 (C-Glc-2)，71.7(C-Glc-4)，62.9 (C-Glc-6)，56.0 (C-17)，55.3 (C-14)，51.4 (C-24)，49.5 (C-9)，43.4 (C-13)，41.1 (C-20)，40.1 (C-5)，39.6 (C-12)，37.3 (C-1)，34.7 (C-4)，34.5 (C-10)，32.1 (C-25)，30.0×2 (C-6, C-2)，28.9 (C-16)，25.6(C-28)，23.3 (C-15)，21.7 (C-26)，21.6 (C-11)，21.2 (C-21)，19.2 (C-27)，13.0 (C-19)，12.5(C-29)，12.2 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，鑒定化合物5為α-波甾醇3-O-β-D-葡萄糖苷。

3.6 化合物6 黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z431 [M - H]-。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ：12.63 (1H, s, 5-OH)，7.76(2H, d,J=8.8Hz,H-2′，6′)，6.92 (2H, d,J=8.8 Hz, H-3′, 5′)，6.41(1H, d,J=2.0 Hz, H-8)，6.21 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6)，5.31 (1H, br s, H-Rha-1)，0.81 (3H, d,J=5.6 Hz, H-Rha-6)。13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ：177.7 (C-4)，164.5 (C-7)，161.3(C-5)，160.0 (C-4′)，157.2 (C-2)，156.5 (C-9)，134.2 (C-3)，130.6 (C-2′, 6′)，120.5(C-1′)，115.4 (C-3′, 5′)，104.0 (C-10)，101.8(C-Rha-1)，98.8 (C-6)，93.8 (C-8)，71.1 (C-Rha-4)，70.6 (C-Rha-3)，70.3 (C-Rha-2)，70.1(C-Rha-5)，17.4 (C-Rha-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，鑒定化合物6為山柰酚3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。

3.7 化合物7 黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z447 [M - H]-。1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ：12.66 (1H, s, 5-OH)，10.85 (1H, s, 7-OH)，9.68 (1H, s, 4′-OH)，9.32 (1H, s, 3′-OH)，7.31 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′)，7.26 (1H, dd,J=2.0, 8.4 Hz, H-6′)，6.87 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5′)，6.40 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8)，6.21 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6)，5.27 (1H, br s, H-Rha-1)，0.83 (3H, d,J=6.0 Hz, H-Rha-6)。13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ：177.7 (C-4)，164.2 (C-7)，161.3(C-5)，157.3 (C-2)，156.4 (C-9)，148.4 (C-4′)，145.2 (C-3′)，134.2 (C-3)，121.1 (C-1′)，120.7 (C-6′)，115.7 (C-2′)，115.5 (C-5′)，104.1 (C-10)，101.8 (C-Rha-1)，98.7 (C-6)，93.6(C-8)，71.2 (C-Rha-4)，70.6 (C-Rha-3)，70.4 (C-Rha-2)，70.0 (C-Rha-5)，17.5 (C-Rha-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，鑒定化合物7為槲皮素3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。

3.8 化合物8 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z974 [M + Na]+。1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5) δ：0.79，0.81，0.87，1.02，1.04，1.22，1.40 (each, 3H, s)，1.48 (3H, d,J=6.4 Hz, H-Fuc-6)，2.16 (3H, s, NHAc)，5.01 (1H, d,J=7.6 Hz, H-Fuc-1)，5.04 (1H, d,J=6.8 Hz, H-Xyl-1)，5.06 (1H, d,J=8.4 Hz, H-Glc-1)，5.26 (1H, br s, H-12)，8.89 (1H, d,J=8.8 Hz, NHAc)。13C-NMR(100 MHz, pyridine-d5)數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，鑒定化合物8為julibroside A3。

3.9 化合物9 白色粉末(甲醇)，MALDI-TOF-MS m/z 1 715 [M + Na]+。1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5) δ：0.95，1.01，1.04，1.11，1.18，1.19，1.90(each, 3H, s)，1.48 (3H, d,J=6.4 Hz, H-Fuc-6)，1.77 (3H, d,J=6.0 Hz, H-Rha-6)，2.11(3H, s, NHAc)，4.92 (1H, overlapped, H-Glc-1)，4.98 (1H, overlapped, H-Fuc-1)，5.09 (1H, d,J=6.5 Hz, H-Xyl-1)，5.34 (1H, d,J=7.6 Hz,H-Glc″-1)，5.61 (1H, br s, H-12)，5.93 (1H, br s, H-Rha-1)，6.07 (1H, d,J=6.5 Hz, H-Glc′-1)，6.28[1H, br s, H-Ara(f)-1]，6.36 (1H, dd,J=5.6 Hz, 10.8 Hz, H-21)，6.69 (1H, dd,J=7.6 Hz, 8.0 Hz, H-6′)，6.97 (1H, d,J=8.8 Hz, H-4′)，7.23 (1H, dd,J=7.6 Hz, 8.8 Hz, H-5′)，8.02 (1H, d,J=8.0 Hz, H-7′)，8.88 (1H, d,J=8.8 Hz, NHAc)。13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5)數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，鑒定化合物9為adianthifolioside A。

3.10 化合物10 白色粉末(甲醇)，MALDI-TOF-MSm/z2 219 [M + Na]+。1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5) δ：0.94，0.99，1.02，1.06，1.16，1.16，1.87 (each, 3H, s)，1.34 (3H, d,J=6.0 Hz, H-Qui-6)，1.47 (3H, d,J=6.0 Hz, H-Fuc-6)，1.54 (6H, s, H-MT-10，H-MT′-10)，1.59 (3H, d,J=4.5 Hz, H-Qui′-6)，1.76 (3H, d,J=5.6 Hz, H-Rha-6)，2.11 (3H, s, NHAc)，4.86 (2H, d,J=7.5 Hz, H-Qui-1，H-Qui′-1)，4.92 (1H, overlapped, H-Glc-1)，4.98 (1H, overlapped, H-Fuc-1)，5.09 (1H, d,J=6.5 Hz, H-Xyl-1)，5.34 (1H, d,J=7.6 Hz, H-Glc″-1)，5.60 (1H, br s, H-12)，5.91 (1H, br s, H-Rha-1)，6.05 (1H, d,J=8.0 Hz, H-Glc′-1)，6.24[1H, br s, H-Ara(f)-1]，8.89 (1H, d,J=8.8 Hz, NHAc)。13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5)數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，鑒定化合物10為julibroside Ⅲ。

表1 化合物8～10的碳譜數(shù)據(jù)(100 MHz，pyridine-d5)

續(xù)表1

4 討論

合歡花醇提取物經(jīng)處理所得大孔樹脂柱70%洗脫部位鎮(zhèn)靜催眠活性最強(qiáng)，經(jīng)薄層檢測(cè)和液質(zhì)分析推測(cè)其中主要是三萜皂苷類化合物。因單體之間結(jié)構(gòu)非常相似，分析分離極為困難。從該部位中分離得到的3個(gè)三萜皂苷化合物量很少，故沒有再進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選。今后考慮深入研究合歡花總皂苷部位的鎮(zhèn)靜催眠活性。

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