楊彩媚

(漳州衛(wèi)生職業(yè)學院，漳州 363000)

目前市場上改善睡眠的藥物主要通過對相關的神經遞質產生作用而延長睡眠時間，但容易產生比較強烈的依賴性和停藥反應，目前仍沒有較為理想的催眠藥[1]。而中藥及其提取物展現出一定的優(yōu)勢。五味子為木蘭科多年生藤本植物五味子的干燥成熟果實，本品酸、甘、溫，歸肺、心、腎經，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心的作用，用于久嗽、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內熱消渴和心悸失眠[2]。半仿生提取法(SBE)是將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結合而創(chuàng)立的一種中藥和方藥提取的新技術[3,4]，該法模擬胃腸道環(huán)境，采用一定pH值的酸性和堿性水依次提取得到有效成分更高的活性混合物。有文獻報道，半仿生提取法有效成分提取量優(yōu)于傳統(tǒng)的水、乙醇-水提取法[5-7]。本研究運用半仿生法提取原理，考查五味子的半仿生提取物對小鼠睡眠功能的影響。

1 材料與試藥

pHS-3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠)；BS110 電子天平(德國賽多利斯公司)；秒表；灌胃針；1 ml注射器等。五味子(江西致和堂藥業(yè)有限公司，產地遼寧，批號16001)；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉(北京普博斯生物科技有限公司，白色粉末，純度大于99%，批號3761)；試驗用水為蒸餾水，濃鹽酸和氫氧化鈉均為分析純。

2 實驗方法

2.1提取溶劑的配制 參照半仿生原理，模擬人體胃腸道環(huán)境，用水作為提取溶劑，1 mol/L的氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸調節(jié)溶劑的pH值，使pH值分別為2.0、7.5和8.3[7]，備用。

2.2五味子半仿生提取物的制備 取五味子100 g，浸泡30 min，依次加入10倍量的pH值分別為2.0、7.5和8.3的酸水和堿水，常壓下加熱回流提取3次，每次30 min。將三煎提取液粗濾，5 000 r/min離心10 min，合并上清液，用旋轉蒸發(fā)器濃縮至200 ml，得到0.5 g/ml的五味子半仿生提取物。

2.3動物分組與劑量選擇 供試動物為ICR小鼠，雄性，160只，體重(20±2)g，由閩侯縣吳氏實驗動物中心提供，動物許可證號SCX(閩)20042002。小鼠正常飼養(yǎng)3 d后，隨機分成四組，每組40只。受試樣品設置低(5倍)、中(10倍)、高(30倍)3個不同的劑量，分別是4.5、9.0和27.0 g/kg，灌胃30 d，末次給藥后20 min測定各指標。

2.4改善睡眠保健功能的評價[8]本實驗依據衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003 年版)，按照改善睡眠功能檢測方法，評價五味子半仿生提取物對小鼠睡眠的改善作用。實驗安排晚8點進行。

2.4.1直接睡眠實驗 五味子半仿生提取物組每日按時灌胃，陰性對照組灌胃給予同等體積的蒸餾水，睡眠以翻正反射消失為指標，末次給藥后觀察各組小鼠是否出現睡眠現象，記錄陰性對照組與五味子給藥組入睡動物數及睡眠時間。

2.4.2延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗 通過前期預實驗，小鼠100%入睡并且睡眠時間不會過長的戊巴比妥鈉的劑量為50 mg/kg。戊巴比妥鈉臨用配制，稱取戊巴比妥鈉0.05 g，生理鹽水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成濃度為5 mg/ml戊巴比妥鈉溶液。各組小鼠末次給予不同劑量五味子提取物及蒸餾水20 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉。在戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠的基礎上，以翻正反射消失為指標，觀察五味子提取物組能否延長小鼠的睡眠時間。

2.4.3戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗 通過前期預實驗，戊巴比妥鈉的最大閾下劑量為30 mg/kg，即使80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉劑量。戊巴比妥鈉臨用配制，稱取戊巴比妥鈉0.03 g，生理鹽水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成濃度為3 mg/ml戊巴比妥鈉溶液。各組小鼠末次給予不同劑量五味子提取物及蒸餾水20 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量，記錄30 min內入睡小鼠數(翻正反射消失達60 s以上者)，計算睡眠發(fā)生數。

2.4.4巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 通過前期預實驗，小鼠100%入睡并且睡眠時間不會過長的巴比妥鈉劑量為300 mg/kg。巴比妥鈉臨用配制，稱取巴比妥鈉0.3 g，取適量生理鹽水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成濃度30 mg/ml巴比妥鈉溶液。各組小鼠末次給予不同劑量五味子提取物及蒸餾水20 min后，腹腔注射巴比妥鈉，以翻正反射消失為指標，觀察睡眠潛伏期(從巴比妥鈉注射開始，至小鼠翻正反射消失達60 s的這段時間為睡眠潛伏期)。

2.4.5數據處理及統(tǒng)計分析 實驗數據用SPSS 13.0軟件進行分析，分析差異顯著性。

3 結果

3.1五味子半仿生提取物對小鼠的直接睡眠實驗 各組小鼠分別給予受試物和蒸餾水后，觀察60 min，給藥組與陰性對照組均無睡眠現象，翻正反射存在。小鼠活動正常，精神狀態(tài)正常，說明五味子半仿生提取物沒有直接催眠的功能，結果見表1。

表1 不同組別小鼠直接睡眠實驗結果

3.2五味子半仿生提取物對延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響 與陰性對照組相比，各給藥組均能明顯延長小鼠的睡眠時間，與陰性對照組比差異顯著(P<0.05)。表明五味子半仿生提取物各劑量組與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用。結果見表2。

3.3五味子半仿生提取物對巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響 各給藥組均不能明顯增加小鼠在30 min內的入睡率，與陰性對照組相比差異性不顯著。結果見表3。

表2 不同組別對延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

注：與陰性對照組比較*P<0.05

表3 不同組別對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗的影響

3.4五味子半仿生提取物對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響 五味子半仿生提取物各劑量組均能明顯縮短小鼠睡眠潛伏期，與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)。結果見表4。

表4 不同組別對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

4 討論

五味子是一種十分珍貴的中藥材，因其具有良好的藥用價值和營養(yǎng)價值，不僅在臨床上廣泛使用，在民間也常常作為養(yǎng)生保健品。我國五味子資源豐富，因此具有極強的市場開發(fā)價值。

本研究首次以半仿生提取法提取五味子中的活性成分，以活性混合物進行改善小鼠睡眠作用的研究，實驗結果表明，五味子半仿生提取物各劑量組(5倍、10倍、30倍)均能延長戊巴比妥鈉睡眠時間，能明顯縮短小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期，并且沒有直接睡眠作用。根據《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)[8]，表明五味子半仿生提取物各劑量組均具有改善睡眠的作用。遺憾的是本實驗根據《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中的要求以10倍劑量作為中間劑量，選取了5倍、30倍作為低、高劑量設置了劑量梯度，而實驗結果顯示這3個劑量組之間并沒有顯著的差異性，應進行進一步的摸索和探討。本研究采用半仿生提取的方法，符合中醫(yī)中藥綜合成分相互作用的特點，提取方法更加簡便，縮短了生產周期，節(jié)約成本。從理論上講，該提取物已經經歷了胃腸道有關酶的生物轉化，生物活性增強，可以作為口服制劑以及保健品的生產原料，為五味子提取物改善睡眠保健品的開發(fā)奠定了基礎。而對于五味子半仿生提取物中的成分以及改善睡眠的作用機制，還有待于進一步深入研究。

1 趙世晶,孫渠.鎮(zhèn)靜催眠藥物的研究進展[J].黑龍江科技信息,2014，15:72

2 中國藥典[S].一部.2015:66-67

3 張兆旺,孫秀梅.試論“半仿生提取法” 制備中藥口服制劑[J].中國中藥雜志, 1995,20(11)：670-673

4 孫秀梅,張兆旺.建立中藥用“半仿生提取”研究的技術平臺[J].中成藥,2006,28(4): 614-616

5 郭志紅,周鴻立. 玉米須多糖和黃酮的半仿生提取及抗氧化活性[J]. 江蘇農業(yè)科學,2015,43(4):273

6 張慧,譚秋龍,黎行山,等.結合響應面分析法優(yōu)化復方金錢草中君藥的半仿生提取工藝[J].廣東藥學院學報,2013,29(1):29-34

7 王蕙,付燕,郎久義,等.酶法及半仿生法提取銀杏黃酮的工藝研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2009,11(2):146-148

8 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術規(guī)范[M].北京:清華同方電子出版社(3版),2003:81-83