師洪鵬

(天津市北辰中醫(yī)醫(yī)院，天津 300400)

傳統(tǒng)化療藥物在治療中存在很多缺陷，利用納米載藥系統(tǒng)將藥物輸送至病變部位，可有效克服這些缺陷[1]。磁性Fe3O4納米粒子[2]是一種特殊的鐵磁性物質(zhì),具有無毒、磁導(dǎo)向性良好和優(yōu)異的生物相容性等優(yōu)勢，在醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒋判晕镔|(zhì)作為載體，與藥物和高分子材料結(jié)合制成磁性藥物制劑的研究一直是當(dāng)前藥物新型制劑最活躍的領(lǐng)域之一[3]。所謂偶氮化合物,是指含有-N=N-鍵的化合物,偶氮基團(tuán)是一種具有光學(xué)活性的基團(tuán),在熱和光的作用下可以進(jìn)行反式-順式(trans-cis)或者順式-反式(cis-trans)可逆反應(yīng),用不同波長λ1和λ2(λ1>λ2)的光束對偶氮化合物進(jìn)行照射,可以使其在順式和反式之間進(jìn)行可逆的轉(zhuǎn)變,從而導(dǎo)致其吸收特性發(fā)生變化[4]。通過對載體的功能化，使得在一定溫度下偶氮雙鍵發(fā)生斷裂，從而達(dá)到藥物釋放的目的。

1 儀器與試藥

電子天平(德國 Sartorius公司)；H66025型超聲清洗機(jī)(無錫市超聲電子設(shè)備有限公司)；XW-80A 旋渦混合儀(上海楚定分析儀器有限公司)；UV-7504型紫外-可見分光光度計(上海新茂儀器有限公司)；UV-2450型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；SF88-DHG-9075AD-電熱鼓風(fēng)干燥箱[西化儀(北京)科技有限公司]；XW-80A 旋渦混合儀(上海楚定分析儀器有限公司)；79-1磁力加熱攪拌器(武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司)；JJ-1增力電動攪拌器(江蘇金壇市宏華儀器廠)。六水合氯化鐵，檸檬酸三鈉二水合物，三水合乙酸鈉，無水乙二胺，二水合磷酸二氫鈉，十二水合磷酸氫二鈉，無水乙醇，乙二醇，4,4’-偶氮(4-氰基戊酸)，N-羥基丁二酰亞胺，鹽酸阿霉素。

2 方法

2.1Azo功能化的Fe3O4磁性納米載體的制備

2.1.1溶劑熱法制備親水性磁性納米Fe3O4取FeCl3·6H2O 1.35 g、檸檬酸三鈉二水合物0.40 g溶于70 ml乙二醇，超聲溶解，攪拌加入3.84 g NaAc·3H2O，在磁力攪拌器上強(qiáng)烈攪拌30 min至溶解，將混合物密封在高壓釜中在200 ℃下加熱12 h，冷卻至室溫，黑色產(chǎn)物即為親水性的磁性納米Fe3O4，先后用乙醇和去離子水清洗多次，最后用去離子水配制成10 mg/ml分散液。

2.1.2Fe3O4-乙二胺納米粒制備 取5 mg乙二胺、0.1 g碳二亞胺(EDC)、20 mg “2.1.1”項中制備的Fe3O4，用pH 7.0的PBS(50 mmol/L)溶液定容至40 ml，室溫下超聲30 min后，磁性分離Fe3O4-乙二胺納米粒，然后用PBS溶液洗滌數(shù)遍以除去未反應(yīng)的乙二胺。所得的Fe3O4-乙二胺納米粒用去離子水配制成10 mg/ml分散液。

2.1.3Fe3O4-乙二胺-Azo納米粒制備 將0.1 g 4,4’-偶氮(4-氰基戊酸，Azo)分散于二甲亞砜(DMSO)，加入0.08 g碳二亞胺(EDC)、0.04 g N-羥基丁二酰亞胺(NHS)混合均勻，再將“2.1.2”項下制備的20 mg Fe3O4-乙二胺納米粒溶于DMSO后加入上述溶液，DMSO定容至40 ml,然后電動攪拌1 h。最后磁性分離Fe3O4-乙二胺-Azo，DMSO洗滌數(shù)遍后，將Fe3O4-乙二胺-Azo用去超純水配制成10 mg/ml分散液。

2.2載藥量和包封率的測定

2.2.1阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取適量的阿霉素，配制濃度分別為10、20、30、40、50和60 μg/ml的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在紫外分光光度計下測480 nm的吸收值。以濃度(C，μg/ml)為橫坐標(biāo)，480 nm吸光度(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到阿霉素的線性回歸方程為A=0.019 2C+0.001 9 (r2=0.999 8)。結(jié)果表明，在10～60 μg/ml范圍內(nèi)，藥物吸光度A與藥物濃度C的線性關(guān)系良好。

2.2.2載藥試驗 取適量阿霉素溶液、碳二亞胺(EDC)0.05 g、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)0.05 g，加入2.5 mg所制備的Fe3O4-乙二胺-Azo水溶液中，用超純水定容至10 ml，避光渦旋振蕩25 min，磁性分離，收集上清，在紫外分光光度計下測480 nm波長處的吸光度。根據(jù)加入的阿霉素和上清中阿霉素的含量，計算載藥量(drug loading，DL)和包封率(entrapment efficiency, EE)。載藥量(DL)=(Wt-Wd)/Wp×100%；包封率(EE)=(Wt-Wd)/Wt×100%。其中，Wt和Wd分別為投入阿霉素的總質(zhì)量和上清中的游離阿霉素質(zhì)量，Wp為磁粒的質(zhì)量。

2.2.3載阿霉素載體在PBS緩沖液中的穩(wěn)定性 為研究載阿霉素載體在PBS緩沖液中的穩(wěn)定性，將適量載阿霉素載體溶解到PBS緩沖液中，對溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，室溫下避光密封保存6 h后，再次進(jìn)行紫外全波長掃描。

3 結(jié)果

3.1載阿霉素載體的表征 游離阿霉素和載阿霉素載體的曲線在480 nm處均有一個峰。見圖1。

圖1 游離阿霉素、Fe3O4、載體和

3.2載藥條件優(yōu)化

3.2.1不同藥物濃度對載藥量的影響 取一定量的阿霉素溶液(500 μg/ml)、碳二亞胺(EDC)0.05 g、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)0.05 g，加入2.5 mg所制備的Fe3O4-乙二胺-Azo水溶液中，用超純水定容至10 ml，溶液中阿霉素濃度分別為25、50、75、100、125和150 μg/ml，避光渦旋振蕩25 min，磁性分離，收集上清，在紫外分光光度計下測480 nm波長處的吸光度，分別計算載藥量。結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，隨著阿霉素濃度的增大，載藥量增大，阿霉素濃度從25 μg/ml到100 μg/ml載藥量明顯增大。150 μg/ml與125 μg/ml相比，載藥量幾乎不再增大，考慮到成本等因素，故選擇阿霉素濃度150 μg/ml。

圖2 3不同藥物濃度對載藥量的影響

3.2.2不同投料比對載藥量和包封率的影響 取3 ml阿霉素溶液(500 μg/ml)、碳二亞胺(EDC)0.05 g、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)0.05 g，分別加入2.5、5、7.5、10、12.5和15 mg所制備的Fe3O4-乙二胺-Azo水溶液中，用超純水定容至10 ml，避光渦旋振蕩25 min，磁性分離，收集上清，在紫外分光光度計下測480 nm波長處的吸收值，分別計算載藥量及包封率。見圖3和圖4。隨著投料比的增加，包封率不斷減小，但載藥量呈下降趨勢，當(dāng)投料比為150 μg/mg時載藥量大幅度下降，故選擇投料比150 μg/mg最佳。

圖3 載阿霉素載體包封率與載體投量的關(guān)系

圖4 載阿霉素載體載藥量與載體投量的關(guān)系

3.2.3最佳載藥時間確定 取6 ml阿霉素溶液(500 μg/ml)、碳二亞胺(EDC)0.1 g、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)0.1 g，加入20 mg所制備的Fe3O4-乙二胺-Azo水溶液中，用超純水定容至20 ml ，避光渦旋振蕩，每2 min取樣1 ml，磁性分離，收集上清，在紫外分光光度計下測480 nm波長處的吸收值，分別計算載藥量。結(jié)果見圖5。隨著載藥時間的增長，載藥量增大，提取時間從2 min增長到20 min時，載藥量明顯增大；載藥時間繼續(xù)增長時，載藥量持平，因此選擇載藥時間在20 min。

3.3載阿霉素載體在PBS緩沖液中的穩(wěn)定性 取適量載阿霉素載體溶解到PBS緩沖液中，對溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，室溫下避光密封保存6 h后，再次進(jìn)行紫外全波長掃描，結(jié)果見圖6。從圖6可以看到，室溫下放置6 h后，載阿霉素載體的紫外全波長有些許的偏移，由此可見，載阿霉素載體在PBS緩沖液中是比較穩(wěn)定的。

圖5 載阿霉素載體載藥量與載藥時間的關(guān)系

圖6 載阿霉素載體在PBS中的紫外全波長圖譜

4 討論

本試驗通過溶劑熱法[5]制備的納米粒子發(fā)育完整，磁性較好，粒度分布均勻。與傳統(tǒng)路線相比，反應(yīng)在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，有效抑制產(chǎn)物氧化，防止空氣中氧污染，大大提高產(chǎn)物純度。制備了Azo功能化的Fe3O4磁性納米載體，該納米載體具有良好的光熱性質(zhì)。通過對其載藥條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳載藥條件，并通過在PBS緩沖液中的穩(wěn)定性試驗，確認(rèn)此載體的可應(yīng)用性，在癌癥治療中很有前景。

1 劉英華. 兩親性納米載藥系統(tǒng)的制備與性能研究[D]. 山東:中國海洋大學(xué),2014：1-2

2 嚴(yán)微，郭嬌嬌，向晨陽，等.磁性四氧化三鐵納米粒子在醫(yī)學(xué)診療領(lǐng)域的研究[J].湖北大學(xué)學(xué)報,2017,39(3):318-319

3 常娟娟. Fe3O4磁性納米復(fù)合物的制備及載藥性能研究[D]. 山西:山西醫(yī)科大學(xué), 2016：1-3

4 王玉昌. 新型偶氮化合物的合成及表征[D].吉林:吉林大學(xué)，2010：1-2

5 張杰，胡登華. 磁性納米Fe3O4粒子的制備與應(yīng)用[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報,2011,33(10):4-5