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        基于線粒體DNA D-loop序列的五華三黃雞遺傳多樣性及其品種起源研究

        2018-01-16 18:38:24黃勛和余哲琪翁茁先溫金星李威娜唐亞東鐘福生
        廣東農(nóng)業(yè)科學 2017年9期
        關(guān)鍵詞:五華三黃雞家雞

        黃勛和,余哲琪,翁茁先,3,溫金星,李威娜,鐘 鳴,唐亞東,鐘福生

        (1.嘉應學院生命科學學院,廣東 梅州 514015;2.廣東省五華三黃雞科技創(chuàng)新中心,廣東 梅州 514015;3.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,湖南 長沙 410128;4.五華縣田家炳中學,廣東 梅州 514400;5.廣東客家黃畜牧有限公司,廣東 興寧 514571)

        家雞是迄今分布最為廣泛的馴養(yǎng)動物之一,為人們提供了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)來源,同時在娛樂(斗雞)、裝飾(羽毛)、宗教(祭祀)等人類活動中起著重要作用[1]。地方家禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分,是長期進化過程中遺留下來的寶貴財產(chǎn)[2-3]。五華三黃雞是優(yōu)良的地方雞種,主要分布在廣東省梅州市五華縣[4-5]。五華三黃雞具有悠久的飼養(yǎng)歷史,因其肉質(zhì)肥嫩鮮美、高蛋白、低脂肪而深受當?shù)厝藗兊南矏?。由于資源保護意識相對薄弱、外地優(yōu)勢雞種和商品雞的沖擊以及人們消費觀念的轉(zhuǎn)變,該品種的種群數(shù)量正不斷減少,遺傳資源保護形勢嚴峻[5]。為科學保護和合理利用五華三黃雞品種資源,嘉應學院對五華三黃雞品種資源、品種特性、保種選育、健康養(yǎng)殖、品種起源等方面進行了系統(tǒng)研究,取得了較大的進展[5-15]。

        動物線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)因結(jié)構(gòu)簡單、含量豐富、突變速率快、母系遺傳等特點,自20世紀90年代開始,被廣泛應用于追溯家雞的馴化歷史[16]。黃勛和等[17]采用PCR產(chǎn)物直接測序法對五華三黃雞豐華和太和兩個群體的mtDNA 控制區(qū)全序進行了分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果表明五華三黃雞與中國紅原雞親緣關(guān)系最近。隨后測定了mtDNA基因組全序列并進行了系統(tǒng)進化分析,結(jié)果也支持控制區(qū)全序的分析結(jié)論[15,18]。運用微衛(wèi)星標記研究表明五華三黃雞保留著較高的遺傳多樣性水平[12-14],但基于mtDNA D-loop的群體遺傳學研究則尚未開展。本研究應用mtDNA D-loop序列對五華三黃雞進行遺傳多樣性分析,評估保種選育效果,檢測種群遺傳動態(tài),同時探討品種的歷史淵源,為五華三黃雞的科學保護和合理開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        供試的120份血液樣品采自五華三黃雞保種場,采集時間為2016年9月。隨機選取保種群體個體于肱靜脈取血,置于終濃度70%乙醇中-80℃保存。采用血液DNA小量提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)提取基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆?。同時在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)下載中國其他地區(qū)和東南亞、南亞家雞以及紅原雞的D-loop序列。

        1.2 PCR擴增與序列測定

        PCR擴增mtDNA D-loop引物:L16750,5'–AGGACTACGGCTTGAAAAGC–3'[19];H522,5'–ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG–3'[20]。反應體系為30 μL,包括10×擴增緩沖液(含Mg2+)3 μL,4種dNTP混合物(2.5 mmol/L)2.4 μL,正反向引物(20 μmol/L)各0.3 μL,模板DNA 1 μL,rTaqDNA聚合酶(5 U/ μL)0.3 μL,滅菌ddH2O 22.7 μL。反應條件為:94℃預變性4 min;94℃變性30 s、63℃復性1 min、72℃延伸50 s,35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認后,送往廣州艾基生物技術(shù)有限公司使用擴增引物進行雙向測序。

        1.3 序列分析

        用Bioedit[21]軟件對測序序列進行人工校對,用ClustalX 1.81[22]軟件進行序列比對,然后以紅原雞mtDNA D-loop序列(GenBank登錄號:NC_007235)作為參考序列,使用DnaSP 5.1[23]軟件定義單倍型,提取變異位點(Variable sites,V),計算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,π)、核苷酸差異均數(shù)(Average number of nucleotide differences,K)、單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd)以及中性檢驗。用MEGA 6.0[24]軟件分析其堿基組成,Kimura 2-parameter(K2P)模型計算群體間的遺傳距離,采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建五華三黃雞單倍型與其他家雞及紅原雞單倍型的無根鄰接樹。單倍型類群的命名參照文獻[25-26]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 遺傳多樣性分析

        除去引物序列,共獲得520 bp mtDNA D-loop序列,其中堿基T、C、A、G的平均含量分別為30.1%、29.9%、27.4%、12.6%,T+A的平均含量為57.5%,C+G的平均含量為42.5%。 120份樣品共檢測到33個突變位點,占總分析位點的6.35%;其中簡約信息位點19個,單一位點突變14個。突變類型均為轉(zhuǎn)換,包括23個T>C轉(zhuǎn)換和10個A>G轉(zhuǎn)換。以NC_007235作為參考序列,在33個突變位點中定義了32種單倍型,包括獨享型單倍型19個,共享型單倍型13個,其中B01為優(yōu)勢單倍型,B20居第2位(表1)??傮w單倍型多樣性為0.913 ± 0.012,核苷酸多樣性為0.01298 ± 0.00051,核苷酸差異均數(shù)為6.750,單倍型遺傳距離為0.013 ± 0.003(表2)。其中單倍型類群B的遺傳多樣性最高,E次之,C最低。中性檢測顯示Fu’sFs值差異顯著,而Tajima’s D值差異不顯著;但獨立檢測發(fā)現(xiàn)除單倍型類群A外,其他單倍型類群的D檢驗均顯示差異顯著。

        表1 五華三黃雞mtDNA D-loop單倍型及其在不同地區(qū)的共享單倍型數(shù)量

        (續(xù)表1)

        表2 五華三黃雞單倍型類群遺傳多樣性統(tǒng)計

        2.2 系統(tǒng)進化分析

        以家雞和紅原雞的390種代表單倍型與五華三黃雞的32種單倍型構(gòu)建無根鄰接樹。無根鄰接樹分化為13枝(A、B、C、D、E、F、G、H、I、W、X、Y和Z),五華三黃雞單倍群主要分布在A、B、C和E 4枝中(圖1),對應的頻率分別為5%(6/120)、52.5%(63/120)、16.67%(20/120)和25.83%(31/120),B為優(yōu)勢單倍型類群。此外,統(tǒng)計了2 299只中國家雞的單倍型,其中與五華三黃雞單倍型類群A共享的單倍型有341個,與B共享的有495個,與C共享的有117個,與E共享的有216個。將廣東省及周邊地區(qū)劃分為華東、華北、華中、華南、西南5個區(qū)域,從表1可見,與五華三黃雞共享單倍型最多的是西南地區(qū)、約占38.12%,華東地區(qū)次之(28.38%),第三是華中地區(qū)(19.32%),第四是華南地區(qū)(9.15%),最后是華北地區(qū)(1.62%)。

        2.3 進化支的地理分布

        在3700只家雞和紅原雞中,A、B、C和E進化枝在大部分地區(qū)都有分布,其中B為優(yōu)勢單倍型類群,約占總數(shù)的29.19%,A次之,占總數(shù)的22.27%;進化枝D、F、G只分布在部分地區(qū),進化枝H、I、W、X、Y和Z僅在少部分地區(qū)特有(表3)。由此可見,家雞和紅原雞呈現(xiàn)出地理分布特征,部分地區(qū)還具有相似的單倍型類群組成。相比之下,江西省、云南省、東南亞、南亞家雞,東南亞紅原雞擁有更豐富的遺傳變異。

        圖1 390種家雞和紅原雞單倍型與32種五華三黃雞單倍型構(gòu)建的無根鄰接樹

        表3 家雞和紅原雞主要進化枝的地理分布

        3 結(jié)論與討論

        本研究應用mtDNA D-loop序列研究了五華三黃雞的遺傳多樣性,并探討其遺傳起源。五華三黃雞mtDNA D-loop的C+G含量低于T+A含量,符合鳥類線粒體控制區(qū)的堿基含量組成,與其他禽類的研究報道相一致[27-30]。衡量群體線粒體DNA的突變程度取決于單倍型遺傳距離、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸差異均數(shù),當遺傳距離大于0.01時則被認為有較大的變異水平[31]。五華三黃雞的遺傳距離為0.01 ±0.003,單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.913±0.012和0.01298±0.00051,高于國內(nèi)許多地方雞品種,如廣西6種地方雞[32]、溧陽雞[33]、麒麟雞[34]。這與微衛(wèi)星標記研究結(jié)論相一致[12-14],說明目前五華三黃雞群體遺傳多樣性較高,有利于后續(xù)的保種選育工作的開展。

        家養(yǎng)動物伴隨著人類的遷移而擴散至世界各地[1]。五華三黃雞主要分布于廣東省梅州市,與福建省龍巖市和江西省贛州市接壤,是粵閩贛客家地區(qū)中心之一??图颐裣凳菑闹性貐^(qū)經(jīng)過多次南遷,融合本地民眾而成[35]。在遷移過程中,家養(yǎng)動物不可避免地伴隨人類擴散至客家地區(qū)。五華三黃雞獨享單倍型數(shù)約占其總數(shù)的60%,說明該品種具有較為久遠的飼養(yǎng)歷史,并且與外界交流較少,仍保留著其獨特的遺傳特性,如尾羽和翅下為白色。中性檢驗發(fā)現(xiàn)五華三黃雞部分單倍型類群經(jīng)歷了群體歷史擴張,但未發(fā)現(xiàn)品種特有的進化枝。五華三黃雞的單倍型組成與廣東省其他地方雞相似,也與江蘇省、江西省、浙江省、東南亞家雞接近,表明五華三黃雞在品種形成過程中受到了人類社會活動和商品貿(mào)易的影響,品種間的遺傳差異正逐步縮小。

        家雞的馴化起源自達爾文時代起就備受關(guān)注和爭議[16]。mtDNA研究認為,南亞、東南亞、中國西南都可能是家雞的起源地之一,并且經(jīng)歷了多次獨立的馴化[25,36-39]。鄰接樹顯示五華三黃雞可劃分為A、B、C和E 共4個單倍型類群,鑒于mtDNA具有嚴格遵循母系遺傳的特性,可認為五華三黃雞具有4個母系來源。五華三黃雞品種形成受到了南遷家雞的影響,但是否遺傳起源于北方,則存在較大的爭論[40-42]。將來需結(jié)合考古學、基因組學等證據(jù)深入探討家雞的遺傳起源和擴散歷史。

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