黃勛和，余哲琪，翁茁先，3，溫金星，李威娜，鐘 鳴，唐亞東，鐘福生

（1.嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州 514015；2.廣東省五華三黃雞科技創(chuàng)新中心，廣東 梅州 514015；3.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；4.五華縣田家炳中學，廣東 梅州 514400；5.廣東客家黃畜牧有限公司，廣東 興寧 514571）

家雞是迄今分布最為廣泛的馴養(yǎng)動物之一，為人們提供了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)來源，同時在娛樂（斗雞）、裝飾（羽毛）、宗教（祭祀）等人類活動中起著重要作用［1］。地方家禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，是長期進化過程中遺留下來的寶貴財產(chǎn)［2-3］。五華三黃雞是優(yōu)良的地方雞種，主要分布在廣東省梅州市五華縣［4-5］。五華三黃雞具有悠久的飼養(yǎng)歷史，因其肉質(zhì)肥嫩鮮美、高蛋白、低脂肪而深受當?shù)厝藗兊南矏?。由于資源保護意識相對薄弱、外地優(yōu)勢雞種和商品雞的沖擊以及人們消費觀念的轉(zhuǎn)變，該品種的種群數(shù)量正不斷減少，遺傳資源保護形勢嚴峻［5］。為科學保護和合理利用五華三黃雞品種資源，嘉應學院對五華三黃雞品種資源、品種特性、保種選育、健康養(yǎng)殖、品種起源等方面進行了系統(tǒng)研究，取得了較大的進展［5-15］。

動物線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）因結(jié)構(gòu)簡單、含量豐富、突變速率快、母系遺傳等特點，自20世紀90年代開始，被廣泛應用于追溯家雞的馴化歷史［16］。黃勛和等［17］采用PCR產(chǎn)物直接測序法對五華三黃雞豐華和太和兩個群體的mtDNA 控制區(qū)全序進行了分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明五華三黃雞與中國紅原雞親緣關(guān)系最近。隨后測定了mtDNA基因組全序列并進行了系統(tǒng)進化分析，結(jié)果也支持控制區(qū)全序的分析結(jié)論［15，18］。運用微衛(wèi)星標記研究表明五華三黃雞保留著較高的遺傳多樣性水平［12-14］，但基于mtDNA D-loop的群體遺傳學研究則尚未開展。本研究應用mtDNA D-loop序列對五華三黃雞進行遺傳多樣性分析，評估保種選育效果，檢測種群遺傳動態(tài)，同時探討品種的歷史淵源，為五華三黃雞的科學保護和合理開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的120份血液樣品采自五華三黃雞保種場，采集時間為2016年9月。隨機選取保種群體個體于肱靜脈取血，置于終濃度70%乙醇中-80℃保存。采用血液DNA小量提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。同時在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載中國其他地區(qū)和東南亞、南亞家雞以及紅原雞的D-loop序列。

1.2 PCR擴增與序列測定

PCR擴增mtDNA D-loop引物：L16750，5'–AGGACTACGGCTTGAAAAGC–3'［19］；H522，5'–ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG–3'［20］。反應體系為30 μL，包括10×擴增緩沖液（含Mg2+）3 μL，4種dNTP混合物（2.5 mmol/L）2.4 μL，正反向引物（20 μmol/L）各0.3 μL，模板DNA 1 μL，rTaqDNA聚合酶（5 U/ μL）0.3 μL，滅菌ddH2O 22.7 μL。反應條件為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s、63℃復性1 min、72℃延伸50 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認后，送往廣州艾基生物技術(shù)有限公司使用擴增引物進行雙向測序。

1.3 序列分析

用Bioedit［21］軟件對測序序列進行人工校對，用ClustalX 1.81［22］軟件進行序列比對，然后以紅原雞mtDNA D-loop序列（GenBank登錄號：NC_007235）作為參考序列，使用DnaSP 5.1［23］軟件定義單倍型，提取變異位點（Variable sites，V），計算核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，π）、核苷酸差異均數(shù)（Average number of nucleotide differences，K）、單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd）以及中性檢驗。用MEGA 6.0［24］軟件分析其堿基組成，Kimura 2-parameter（K2P）模型計算群體間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建五華三黃雞單倍型與其他家雞及紅原雞單倍型的無根鄰接樹。單倍型類群的命名參照文獻［25-26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

除去引物序列，共獲得520 bp mtDNA D-loop序列，其中堿基T、C、A、G的平均含量分別為30.1%、29.9%、27.4%、12.6%，T+A的平均含量為57.5%，C+G的平均含量為42.5%。 120份樣品共檢測到33個突變位點，占總分析位點的6.35%；其中簡約信息位點19個，單一位點突變14個。突變類型均為轉(zhuǎn)換，包括23個T＞C轉(zhuǎn)換和10個A＞G轉(zhuǎn)換。以NC_007235作為參考序列，在33個突變位點中定義了32種單倍型，包括獨享型單倍型19個，共享型單倍型13個，其中B01為優(yōu)勢單倍型，B20居第2位（表1）?？傮w單倍型多樣性為0.913 ± 0.012，核苷酸多樣性為0.01298 ± 0.00051，核苷酸差異均數(shù)為6.750，單倍型遺傳距離為0.013 ± 0.003（表2）。其中單倍型類群B的遺傳多樣性最高，E次之，C最低。中性檢測顯示Fu’sFs值差異顯著，而Tajima’s D值差異不顯著；但獨立檢測發(fā)現(xiàn)除單倍型類群A外，其他單倍型類群的D檢驗均顯示差異顯著。

表1 五華三黃雞mtDNA D-loop單倍型及其在不同地區(qū)的共享單倍型數(shù)量

（續(xù)表1）

表2 五華三黃雞單倍型類群遺傳多樣性統(tǒng)計

2.2 系統(tǒng)進化分析

以家雞和紅原雞的390種代表單倍型與五華三黃雞的32種單倍型構(gòu)建無根鄰接樹。無根鄰接樹分化為13枝（A、B、C、D、E、F、G、H、I、W、X、Y和Z），五華三黃雞單倍群主要分布在A、B、C和E 4枝中（圖1），對應的頻率分別為5%（6/120）、52.5%（63/120）、16.67%（20/120）和25.83%（31/120），B為優(yōu)勢單倍型類群。此外，統(tǒng)計了2 299只中國家雞的單倍型，其中與五華三黃雞單倍型類群A共享的單倍型有341個，與B共享的有495個，與C共享的有117個，與E共享的有216個。將廣東省及周邊地區(qū)劃分為華東、華北、華中、華南、西南5個區(qū)域，從表1可見，與五華三黃雞共享單倍型最多的是西南地區(qū)、約占38.12%，華東地區(qū)次之（28.38%），第三是華中地區(qū)（19.32%），第四是華南地區(qū)（9.15%），最后是華北地區(qū)（1.62%）。

2.3 進化支的地理分布

在3700只家雞和紅原雞中，A、B、C和E進化枝在大部分地區(qū)都有分布，其中B為優(yōu)勢單倍型類群，約占總數(shù)的29.19%，A次之，占總數(shù)的22.27%；進化枝D、F、G只分布在部分地區(qū)，進化枝H、I、W、X、Y和Z僅在少部分地區(qū)特有（表3）。由此可見，家雞和紅原雞呈現(xiàn)出地理分布特征，部分地區(qū)還具有相似的單倍型類群組成。相比之下，江西省、云南省、東南亞、南亞家雞，東南亞紅原雞擁有更豐富的遺傳變異。

圖1 390種家雞和紅原雞單倍型與32種五華三黃雞單倍型構(gòu)建的無根鄰接樹

表3 家雞和紅原雞主要進化枝的地理分布

3 結(jié)論與討論

本研究應用mtDNA D-loop序列研究了五華三黃雞的遺傳多樣性，并探討其遺傳起源。五華三黃雞mtDNA D-loop的C+G含量低于T+A含量，符合鳥類線粒體控制區(qū)的堿基含量組成，與其他禽類的研究報道相一致［27-30］。衡量群體線粒體DNA的突變程度取決于單倍型遺傳距離、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸差異均數(shù)，當遺傳距離大于0.01時則被認為有較大的變異水平［31］。五華三黃雞的遺傳距離為0.01 ±0.003，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.913±0.012和0.01298±0.00051，高于國內(nèi)許多地方雞品種，如廣西6種地方雞［32］、溧陽雞［33］、麒麟雞［34］。這與微衛(wèi)星標記研究結(jié)論相一致［12-14］，說明目前五華三黃雞群體遺傳多樣性較高，有利于后續(xù)的保種選育工作的開展。

家養(yǎng)動物伴隨著人類的遷移而擴散至世界各地［1］。五華三黃雞主要分布于廣東省梅州市，與福建省龍巖市和江西省贛州市接壤，是粵閩贛客家地區(qū)中心之一?？图颐裣凳菑闹性貐^(qū)經(jīng)過多次南遷，融合本地民眾而成［35］。在遷移過程中，家養(yǎng)動物不可避免地伴隨人類擴散至客家地區(qū)。五華三黃雞獨享單倍型數(shù)約占其總數(shù)的60%，說明該品種具有較為久遠的飼養(yǎng)歷史，并且與外界交流較少，仍保留著其獨特的遺傳特性，如尾羽和翅下為白色。中性檢驗發(fā)現(xiàn)五華三黃雞部分單倍型類群經(jīng)歷了群體歷史擴張，但未發(fā)現(xiàn)品種特有的進化枝。五華三黃雞的單倍型組成與廣東省其他地方雞相似，也與江蘇省、江西省、浙江省、東南亞家雞接近，表明五華三黃雞在品種形成過程中受到了人類社會活動和商品貿(mào)易的影響，品種間的遺傳差異正逐步縮小。

家雞的馴化起源自達爾文時代起就備受關(guān)注和爭議［16］。mtDNA研究認為，南亞、東南亞、中國西南都可能是家雞的起源地之一，并且經(jīng)歷了多次獨立的馴化［25，36-39］。鄰接樹顯示五華三黃雞可劃分為A、B、C和E 共4個單倍型類群，鑒于mtDNA具有嚴格遵循母系遺傳的特性，可認為五華三黃雞具有4個母系來源。五華三黃雞品種形成受到了南遷家雞的影響，但是否遺傳起源于北方，則存在較大的爭論［40-42］。將來需結(jié)合考古學、基因組學等證據(jù)深入探討家雞的遺傳起源和擴散歷史。

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