黃勛和，余哲琪，翁茁先，3，溫金星，李威娜，鐘 鳴，唐亞?wèn)|，鐘福生

（1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015；2.廣東省五華三黃雞科技創(chuàng)新中心，廣東 梅州 514015；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.五華縣田家炳中學(xué)，廣東 梅州 514400；5.廣東客家黃畜牧有限公司，廣東 興寧 514571）

家雞是迄今分布最為廣泛的馴養(yǎng)動(dòng)物之一，為人們提供了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)來(lái)源，同時(shí)在娛樂(lè)（斗雞）、裝飾（羽毛）、宗教（祭祀）等人類(lèi)活動(dòng)中起著重要作用［1］。地方家禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，是長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中遺留下來(lái)的寶貴財(cái)產(chǎn)［2-3］。五華三黃雞是優(yōu)良的地方雞種，主要分布在廣東省梅州市五華縣［4-5］。五華三黃雞具有悠久的飼養(yǎng)歷史，因其肉質(zhì)肥嫩鮮美、高蛋白、低脂肪而深受當(dāng)?shù)厝藗兊南矏?ài)。由于資源保護(hù)意識(shí)相對(duì)薄弱、外地優(yōu)勢(shì)雞種和商品雞的沖擊以及人們消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，該品種的種群數(shù)量正不斷減少，遺傳資源保護(hù)形勢(shì)嚴(yán)峻［5］。為科學(xué)保護(hù)和合理利用五華三黃雞品種資源，嘉應(yīng)學(xué)院對(duì)五華三黃雞品種資源、品種特性、保種選育、健康養(yǎng)殖、品種起源等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，取得了較大的進(jìn)展［5-15］。

動(dòng)物線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、含量豐富、突變速率快、母系遺傳等特點(diǎn)，自20世紀(jì)90年代開(kāi)始，被廣泛應(yīng)用于追溯家雞的馴化歷史［16］。黃勛和等［17］采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)五華三黃雞豐華和太和兩個(gè)群體的mtDNA 控制區(qū)全序進(jìn)行了分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明五華三黃雞與中國(guó)紅原雞親緣關(guān)系最近。隨后測(cè)定了mtDNA基因組全序列并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果也支持控制區(qū)全序的分析結(jié)論［15，18］。運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記研究表明五華三黃雞保留著較高的遺傳多樣性水平［12-14］，但基于mtDNA D-loop的群體遺傳學(xué)研究則尚未開(kāi)展。本研究應(yīng)用mtDNA D-loop序列對(duì)五華三黃雞進(jìn)行遺傳多樣性分析，評(píng)估保種選育效果，檢測(cè)種群遺傳動(dòng)態(tài)，同時(shí)探討品種的歷史淵源，為五華三黃雞的科學(xué)保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的120份血液樣品采自五華三黃雞保種場(chǎng)，采集時(shí)間為2016年9月。隨機(jī)選取保種群體個(gè)體于肱靜脈取血，置于終濃度70%乙醇中-80℃保存。采用血液DNA小量提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載中國(guó)其他地區(qū)和東南亞、南亞家雞以及紅原雞的D-loop序列。

1.2 PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增mtDNA D-loop引物：L16750，5'–AGGACTACGGCTTGAAAAGC–3'［19］；H522，5'–ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG–3'［20］。反應(yīng)體系為30 μL，包括10×擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）3 μL，4種dNTP混合物（2.5 mmol/L）2.4 μL，正反向引物（20 μmol/L）各0.3 μL，模板DNA 1 μL，rTaqDNA聚合酶（5 U/ μL）0.3 μL，滅菌ddH2O 22.7 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s、63℃復(fù)性1 min、72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，送往廣州艾基生物技術(shù)有限公司使用擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 序列分析

用Bioedit［21］軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行人工校對(duì)，用ClustalX 1.81［22］軟件進(jìn)行序列比對(duì)，然后以紅原雞mtDNA D-loop序列（GenBank登錄號(hào)：NC_007235）作為參考序列，使用DnaSP 5.1［23］軟件定義單倍型，提取變異位點(diǎn)（Variable sites，V），計(jì)算核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，π）、核苷酸差異均數(shù)（Average number of nucleotide differences，K）、單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd）以及中性檢驗(yàn)。用MEGA 6.0［24］軟件分析其堿基組成，Kimura 2-parameter（K2P）模型計(jì)算群體間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建五華三黃雞單倍型與其他家雞及紅原雞單倍型的無(wú)根鄰接樹(shù)。單倍型類(lèi)群的命名參照文獻(xiàn)［25-26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

除去引物序列，共獲得520 bp mtDNA D-loop序列，其中堿基T、C、A、G的平均含量分別為30.1%、29.9%、27.4%、12.6%，T+A的平均含量為57.5%，C+G的平均含量為42.5%。 120份樣品共檢測(cè)到33個(gè)突變位點(diǎn)，占總分析位點(diǎn)的6.35%；其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)19個(gè)，單一位點(diǎn)突變14個(gè)。突變類(lèi)型均為轉(zhuǎn)換，包括23個(gè)T＞C轉(zhuǎn)換和10個(gè)A＞G轉(zhuǎn)換。以NC_007235作為參考序列，在33個(gè)突變位點(diǎn)中定義了32種單倍型，包括獨(dú)享型單倍型19個(gè)，共享型單倍型13個(gè)，其中B01為優(yōu)勢(shì)單倍型，B20居第2位（表1）。總體單倍型多樣性為0.913 ± 0.012，核苷酸多樣性為0.01298 ± 0.00051，核苷酸差異均數(shù)為6.750，單倍型遺傳距離為0.013 ± 0.003（表2）。其中單倍型類(lèi)群B的遺傳多樣性最高，E次之，C最低。中性檢測(cè)顯示Fu’sFs值差異顯著，而Tajima’s D值差異不顯著；但獨(dú)立檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除單倍型類(lèi)群A外，其他單倍型類(lèi)群的D檢驗(yàn)均顯示差異顯著。

表1 五華三黃雞mtDNA D-loop單倍型及其在不同地區(qū)的共享單倍型數(shù)量

（續(xù)表1）

表2 五華三黃雞單倍型類(lèi)群遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

以家雞和紅原雞的390種代表單倍型與五華三黃雞的32種單倍型構(gòu)建無(wú)根鄰接樹(shù)。無(wú)根鄰接樹(shù)分化為13枝（A、B、C、D、E、F、G、H、I、W、X、Y和Z），五華三黃雞單倍群主要分布在A、B、C和E 4枝中（圖1），對(duì)應(yīng)的頻率分別為5%（6/120）、52.5%（63/120）、16.67%（20/120）和25.83%（31/120），B為優(yōu)勢(shì)單倍型類(lèi)群。此外，統(tǒng)計(jì)了2 299只中國(guó)家雞的單倍型，其中與五華三黃雞單倍型類(lèi)群A共享的單倍型有341個(gè)，與B共享的有495個(gè)，與C共享的有117個(gè)，與E共享的有216個(gè)。將廣東省及周邊地區(qū)劃分為華東、華北、華中、華南、西南5個(gè)區(qū)域，從表1可見(jiàn)，與五華三黃雞共享單倍型最多的是西南地區(qū)、約占38.12%，華東地區(qū)次之（28.38%），第三是華中地區(qū)（19.32%），第四是華南地區(qū)（9.15%），最后是華北地區(qū)（1.62%）。

2.3 進(jìn)化支的地理分布

在3700只家雞和紅原雞中，A、B、C和E進(jìn)化枝在大部分地區(qū)都有分布，其中B為優(yōu)勢(shì)單倍型類(lèi)群，約占總數(shù)的29.19%，A次之，占總數(shù)的22.27%；進(jìn)化枝D、F、G只分布在部分地區(qū)，進(jìn)化枝H、I、W、X、Y和Z僅在少部分地區(qū)特有（表3）。由此可見(jiàn)，家雞和紅原雞呈現(xiàn)出地理分布特征，部分地區(qū)還具有相似的單倍型類(lèi)群組成。相比之下，江西省、云南省、東南亞、南亞家雞，東南亞紅原雞擁有更豐富的遺傳變異。

圖1 390種家雞和紅原雞單倍型與32種五華三黃雞單倍型構(gòu)建的無(wú)根鄰接樹(shù)

表3 家雞和紅原雞主要進(jìn)化枝的地理分布

3 結(jié)論與討論

本研究應(yīng)用mtDNA D-loop序列研究了五華三黃雞的遺傳多樣性，并探討其遺傳起源。五華三黃雞mtDNA D-loop的C+G含量低于T+A含量，符合鳥(niǎo)類(lèi)線粒體控制區(qū)的堿基含量組成，與其他禽類(lèi)的研究報(bào)道相一致［27-30］。衡量群體線粒體DNA的突變程度取決于單倍型遺傳距離、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸差異均數(shù)，當(dāng)遺傳距離大于0.01時(shí)則被認(rèn)為有較大的變異水平［31］。五華三黃雞的遺傳距離為0.01 ±0.003，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.913±0.012和0.01298±0.00051，高于國(guó)內(nèi)許多地方雞品種，如廣西6種地方雞［32］、溧陽(yáng)雞［33］、麒麟雞［34］。這與微衛(wèi)星標(biāo)記研究結(jié)論相一致［12-14］，說(shuō)明目前五華三黃雞群體遺傳多樣性較高，有利于后續(xù)的保種選育工作的開(kāi)展。

家養(yǎng)動(dòng)物伴隨著人類(lèi)的遷移而擴(kuò)散至世界各地［1］。五華三黃雞主要分布于廣東省梅州市，與福建省龍巖市和江西省贛州市接壤，是粵閩贛客家地區(qū)中心之一?？图颐裣凳菑闹性貐^(qū)經(jīng)過(guò)多次南遷，融合本地民眾而成［35］。在遷移過(guò)程中，家養(yǎng)動(dòng)物不可避免地伴隨人類(lèi)擴(kuò)散至客家地區(qū)。五華三黃雞獨(dú)享單倍型數(shù)約占其總數(shù)的60%，說(shuō)明該品種具有較為久遠(yuǎn)的飼養(yǎng)歷史，并且與外界交流較少，仍保留著其獨(dú)特的遺傳特性，如尾羽和翅下為白色。中性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)五華三黃雞部分單倍型類(lèi)群經(jīng)歷了群體歷史擴(kuò)張，但未發(fā)現(xiàn)品種特有的進(jìn)化枝。五華三黃雞的單倍型組成與廣東省其他地方雞相似，也與江蘇省、江西省、浙江省、東南亞家雞接近，表明五華三黃雞在品種形成過(guò)程中受到了人類(lèi)社會(huì)活動(dòng)和商品貿(mào)易的影響，品種間的遺傳差異正逐步縮小。

家雞的馴化起源自達(dá)爾文時(shí)代起就備受關(guān)注和爭(zhēng)議［16］。mtDNA研究認(rèn)為，南亞、東南亞、中國(guó)西南都可能是家雞的起源地之一，并且經(jīng)歷了多次獨(dú)立的馴化［25，36-39］。鄰接樹(shù)顯示五華三黃雞可劃分為A、B、C和E 共4個(gè)單倍型類(lèi)群，鑒于mtDNA具有嚴(yán)格遵循母系遺傳的特性，可認(rèn)為五華三黃雞具有4個(gè)母系來(lái)源。五華三黃雞品種形成受到了南遷家雞的影響，但是否遺傳起源于北方，則存在較大的爭(zhēng)論［40-42］。將來(lái)需結(jié)合考古學(xué)、基因組學(xué)等證據(jù)深入探討家雞的遺傳起源和擴(kuò)散歷史。

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