康萍芝，張麗榮，杜玉寧，白小軍，張治科

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/寧夏植物病蟲害防治重點實驗室，寧夏 銀川 750002）

寧夏中部干旱帶壓砂西瓜地多年來由于壓砂地嚴(yán)重缺水、輪作困難而連茬種植，加之生產(chǎn)上長期和大量使用化肥和化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致壓砂地肥力衰退、土壤老化、鹽堿化、產(chǎn)品品質(zhì)明顯下降、枯萎病等土傳病害和連作障礙等問題非常嚴(yán)重，使壓砂瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)和健康發(fā)展面臨著嚴(yán)峻的考驗和挑戰(zhàn)。

生產(chǎn)中輪作、培育抗病品種、砧木嫁接等非化學(xué)防控措施經(jīng)常被推薦用于控制枯萎病等土傳病害，這些技術(shù)措施雖然效果明顯，但由于自身存在著某些缺點導(dǎo)致在生產(chǎn)中難以實施或大面積推廣應(yīng)用，而施用生物有機(jī)肥目前被認(rèn)為是一種可持續(xù)的生物防控土傳病害的新途徑。許多研究表明，生物有機(jī)肥除了有促進(jìn)作物生長、提高產(chǎn)量［1-3］和改善品質(zhì)的作用外［4-9］，還有減少和緩解因連作而導(dǎo)致的土傳病害的作用［10-13］。本試驗以壓砂西瓜枯萎病為靶標(biāo)對象，采用室內(nèi)稀釋平板涂抹法、Biolog-ECO微平板法和田間穴施方法，探討了施用生物有機(jī)肥對壓砂西瓜的促生長作用、枯萎病的防控效果及對土壤微生物區(qū)系和群落功能多樣性的影響，篩選出了防控壓砂西瓜枯萎病或減輕連作障礙的生物有機(jī)肥最佳用量和有效方法，為解決我區(qū)壓砂瓜連作障礙瓶頸問題提供重要的理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試肥料：馕播王復(fù)合微生物肥或生物有機(jī)肥（江蘇省江陰市聯(lián)業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)）有效活菌數(shù)（CFU）≥0.20億/g、有機(jī)質(zhì)（以干基計）≥40.0%、游離氨基酸（以干基計）≥0.70%、總養(yǎng)分（以干基計）10%～15%、pH 5.5～8.5；金菌冠微生物菌劑（山東金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)）有效活菌數(shù)≥5.0億/g、有機(jī)質(zhì)≥45.0%，特別添加黃腐酸鉀。

供試作物為壓砂西瓜，品種為金城五號。

供試土壤為連作12年的老壓砂西瓜地，土壤肥力差。土壤理化性狀為：pH值8.0、全鹽0.66 g/kg、有機(jī)質(zhì)5.22 g/kg、全量氮0.39 g/kg、全量磷0.51 g/kg、全量鉀22.9 mg/kg、速效氮80 mg/kg、速效磷8.12 mg/kg、速效鉀132 mg/kg。

供試培養(yǎng)基均使用選擇性培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、真菌用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、放線菌用改良高氏1號培養(yǎng)基、尖孢鐮刀菌使用Komada選擇性培養(yǎng)基測定。

主要儀器設(shè)備：立式電熱蒸汽壓力滅菌鍋；干燥箱；空氣浴培養(yǎng)搖床；超凈工作臺；霉菌培養(yǎng)箱；電子天平等儀器設(shè)備。

1.2 試驗方法

試驗于2016年在寧夏中衛(wèi)市香山鄉(xiāng)紅圈子村三合隊進(jìn)行，選擇連作12年的西瓜壓砂地進(jìn)行田間試驗，試驗設(shè)馕播王生物有機(jī)肥100、200、300、400 g/穴和金菌冠微生物菌劑100 g/穴、單施基質(zhì)200 g/穴（處理1～處理6）及常規(guī)種植施肥（CK）7個處理，每個處理3次重復(fù)，試驗地種植管理水平和條件相同。

施肥采用穴施方法，先挖20 cm×30～50 cm×20～30 cm的坑穴，再將馕播王生物有機(jī)肥撒入坑內(nèi)與土拌勻，盡可能往下翻至30 cm，然后覆土覆砂。

采用五點取樣法，分別對不同處理壓砂瓜根圍土壤進(jìn)行取樣，挖開砂采集土壤深度為0～15 cm，將不同位點的土樣混勻后裝入保鮮袋內(nèi)密閉，帶回試驗室內(nèi)進(jìn)行土壤微生物種類分離和數(shù)量測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生長指標(biāo)和產(chǎn)量測定 施肥后于生育期內(nèi)使用卷尺和游標(biāo)卡尺測定壓砂西瓜主蔓長、莖粗、葉片數(shù)等生長指標(biāo)，每個處理測定株數(shù)為30株；收獲期測定整個試驗小區(qū)的產(chǎn)量，并計算其增產(chǎn)效果。

1.3.2 病害發(fā)生情況調(diào)查 重點調(diào)查整個試驗小區(qū)壓砂西瓜生育期內(nèi)的死苗、枯萎病發(fā)生情況，并計算其死苗率、病株率和相對防效。

1.3.3 土壤樣品理化性狀測定 測定指標(biāo)包括土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、全鹽、全量氮、全量磷、全鉀、速效氮、速效磷、速效鉀等。其中，土壤 pH值測定采用酸度計；全鹽測定采用電導(dǎo)率法；有機(jī)質(zhì)測定采用重鉻酸鉀滴定法；全量氮測定采用凱氏定氮法；速效氮測定采用擴(kuò)散吸收法；全量磷、速效磷測定采用分光光度計法；全鉀測定采用原子吸收分光光度法；速效鉀測定采用火焰光度法。

1.3.4 土壤微生物區(qū)系及病原菌數(shù)量測定 采用平板涂抹法。土壤懸液制備及分離方法：取10 g西瓜根部土壤樣品，倒入裝有100 mL滅菌水的150 mL三角瓶中，放入搖床上振蕩15min后靜置，再稀釋成102、103、104、105、106倍的土壤懸液，取0.2 mL加入到已凝固的選擇性培養(yǎng)基平板上涂抹均勻，然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d左右，觀察菌落出現(xiàn)情況，分別調(diào)查土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌及尖孢鐮刀菌的數(shù)量。細(xì)菌使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；真菌用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基；放線菌用改良高氏1號培養(yǎng)基；西瓜枯萎病菌（尖孢鐮刀菌）采用Komada選擇性培養(yǎng)基。

1.3.5 土壤微生物群落功能多樣性測定 采用Biolog-ECO微平板法。稱取10 g鮮土（稱量前測量含水量），加入90 mL無菌生理鹽水中稀釋，在搖床里振搖30 min，靜止沉淀3～5 min，然后進(jìn)行100倍稀釋，以每孔150 μL稀釋液加入微孔板中，將制備好的菌懸液倒入無菌移液槽中，使用八孔移液器將其接種于微平板的96孔中。接種好的微平板放到鋪有六層紗布的塑料盒中，為防止微平板鑒定孔中的菌懸液揮發(fā)，紗布保持一定的濕度。塑料盒用保鮮膜包裹，保鮮膜上用注射針頭扎若干個小眼，以保證微生物的培養(yǎng)所需要的氧氣，將微平板避光培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

使用Excel 2003和SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用 Duncan's 法進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析；采用Biolog微平板培養(yǎng)96h的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用Excel和 DPSv3.11、CANOCO軟件對ECO板結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析?？椎钠骄伾兓剩ˋWCD）計算方法如下：

式中，C為處理每個碳源孔的光密度值；R為對照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)。

通過豐富度、多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)等來表征土壤微生物群落的功能多樣性，并分析其差異顯著性；將BiologGN2微平板中的氨基酸類、糖類、羧酸類、聚合物類和多種碳源等物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（PCA），以便了解土壤微生物的主要類群。

2 結(jié)果與分析

2.1 穴施生物有機(jī)肥對壓砂西瓜生長指標(biāo)、產(chǎn)量的影響及枯萎病防效測定

從表1、表2可以看出，單施不同用量生物有機(jī)肥對西瓜有明顯促生長作用，與金菌冠微生物菌劑、常規(guī)施肥（CK）相比，各處理西瓜死苗率有所降低，主蔓長、葉片數(shù)、分枝數(shù)、莖粗均顯示出明顯優(yōu)勢，差異顯著，對枯萎病的防效達(dá)77.21%～88.73%，增產(chǎn)率達(dá)14.7%～26.8%，其中處理2、處理3、處理4效果比較明顯，產(chǎn)量差異顯著，防效高。

表1 穴施生物有機(jī)肥對壓砂西瓜死苗率、生長指標(biāo)及枯萎病防控的影響

表2 穴施生物有機(jī)肥對壓砂西瓜產(chǎn)量的影響

圖1 生物有機(jī)肥對壓砂西瓜土壤微生物區(qū)系及尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

2.2 穴施生物有機(jī)肥對壓砂西瓜土壤微生物區(qū)系及尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

試驗結(jié)果（圖1）表明，施以不同用量的生物有機(jī)肥后，壓砂地土壤微生物區(qū)系發(fā)生不同程度變化，其中真菌數(shù)量處于先下降后緩慢上升趨勢，細(xì)菌、放線菌呈上升趨勢，尖孢鐮刀菌呈下降趨勢，且各施肥處理均好于對照生物菌肥、單施基質(zhì)和常規(guī)對照，尤其是金菌冠微生物菌劑處理效果較差。

2.3 穴施生物有機(jī)肥對壓砂西瓜土壤微生物群落功能多樣性的影響

采用Biolog方法進(jìn)行單施生物有機(jī)肥對土壤微生物群落功能多樣性的影響測定。結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時間的延長，施用生物有機(jī)肥處理后，壓砂西瓜土壤微生物群落利用全部碳源和羧酸類、碳水化合物、氨基酸、羧酸等6種碳源總體呈上升趨勢，其中處理1～處理4高于CK，而處理5、處理6低于CK（圖2、圖3），說明施用生物有機(jī)肥后土壤微生物群落對全部碳源的利用能力較高，微生物代謝活性較強(qiáng)；不同處理對土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的影響也存在一定的差異性（表3），物種豐富度、優(yōu)勢度指數(shù)、多樣性指數(shù)均有所上升；從樣品主成分分析的散布區(qū)域（圖4）可以看出，處理2～處理4處于同一區(qū)域內(nèi)分布相對集中，相似度較高，對碳源的利用能力比較強(qiáng)，而其余處理土壤樣品分布差異較大。

圖2 不同處理對壓砂西瓜土壤微生物利用全部碳源的AWCD值

圖3 不同處理對壓砂西瓜土壤微生物利用6種不同碳源的AWCD值

表3 不同處理土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

西瓜枯萎病是西瓜生產(chǎn)中較難防治的一種土傳病害。多年來，國內(nèi)外許多專家學(xué)者都在尋找防控西瓜枯萎病的有效途徑，而生物有機(jī)肥以其獨特的優(yōu)勢成為目前生物防治研究的熱門和安全、環(huán)保的生防措施。本研究通過兩年的田間多點試驗，篩選出了有效防控壓砂西瓜枯萎病或減輕連作障礙的生物有機(jī)肥最佳用量，建議連作10年左右的老砂地，西瓜苗根部穴施生物有機(jī)肥適宜用量為200～300 g/穴；而連作5年左右的新砂地，西瓜苗根部穴施生物有機(jī)肥適宜用量為140～200 g/穴；若在坑內(nèi)苗旁施用生物有機(jī)肥，可加大用量至400 g/穴。

圖4 不同處理土壤微生物群落功能多樣性主成分分析

同時，研究結(jié)果也表明，施用生物有機(jī)肥可顯著提高壓砂西瓜根部土壤有益微生物的數(shù)量，且對壓砂西瓜植株具有明顯的促生長作用和防病效果。本試驗施用不同用量的生物有機(jī)肥后，土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量顯著增加，尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著減少，真菌數(shù)量先減少后緩慢增加，且施肥量越大，效果越明顯；施用生物有機(jī)肥還可對壓砂西瓜產(chǎn)生明顯的促生長作用，這一結(jié)果與凌寧等［14］的研究結(jié)果相似。另外，施用生物有機(jī)肥也對西瓜枯萎病具有一定的防控效果，具體表現(xiàn)為可延遲西瓜發(fā)病時間，病株率降低，提早成熟期7～10 d，且隨著生物有機(jī)肥施用量的增加，防病效果越好。

土壤微生物區(qū)系失去平衡是作物連作產(chǎn)生障礙的主要因素之一。因此，在研究克服連作障礙的施肥過程中，不僅要抑制土傳病原菌的數(shù)量，而且要提高有益細(xì)菌和放線菌的數(shù)量［15－16］。本試驗結(jié)果表明，施用生物有機(jī)肥可以明顯增加壓砂西瓜根部土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量，大大降低尖孢鐮刀菌的數(shù)量，使土壤微生物區(qū)系朝著有利的方向發(fā)展。分析其原因，主要是生物有機(jī)肥中的有益菌群可直接帶入或刺激產(chǎn)生大量的有益微生物，而生物有機(jī)肥中添加的解淀粉芽孢桿菌、木霉等拮抗菌及其代謝產(chǎn)物通過競爭、重寄生、抗生等作用可抑制土壤中尖孢鐮刀菌的生長，降低病原菌數(shù)量，有利地調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境，從而減輕壓砂西瓜枯萎病等土傳病害的發(fā)生。

此外，本研究通過常規(guī)微生物平板計數(shù)和Biolog技術(shù)相結(jié)合的研究方法，能夠較為真實地反映出壓砂西瓜根部土壤中微生物種群數(shù)量和功能結(jié)構(gòu)多樣性所發(fā)生的變化，為壓砂瓜枯萎病等土傳病害的有效生物防治和連作障礙機(jī)理的研究提供重要的理論和實踐依據(jù)。

［1］劉旭，邵孝侯，毛欣宇，等.EM生物有機(jī)肥對甜玉米生長發(fā)育及土壤特性的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：301-302.

［2］胡誠，曹志平，胡菊，等.長期施用生物有機(jī)肥土壤的氮礦化［J］.生態(tài)學(xué)報，2009，29（4）：2080-2086.

［3］曹丹，宗良綱，肖峻，等.生物肥對有機(jī)黃瓜生長及土壤生物學(xué)特性的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2010，21（10）：2587-2592.

［4］劉長慶，李天玉，王德科，等.生物有機(jī)肥在黃瓜上的應(yīng)用效果研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15（1）：180-182.

［5］高峰，曹林奎，張浩.生物有機(jī)肥在茄子上的應(yīng)用［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，19（2）：55-57.

［6］趙曉萍.生物有機(jī)肥對西瓜生長及產(chǎn)量、品質(zhì)的影響［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（16）：30.

［7］劉方春，邢尚軍，馬海林，等.生物肥對冬棗生物學(xué)特性及產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.水土保持學(xué)報，2010，24（6）：222-226.

［8］徐宗才，馬明呈，肖愛國.施用酵素菌有機(jī)肥對番茄生長和產(chǎn)量的影響［J］.北方園藝，2010（11）：37-38.

［9］李先，劉強(qiáng)，榮湘民，等.有機(jī)肥對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)及氮肥利用率的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，36（3）：258-262.

［10］何欣，郝文雅，楊興明，等.生物有機(jī)肥對香蕉植株生長和香蕉枯萎病防治的研究［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2010，16（4）：978-985.

［11］楊廣超.西瓜自毒作用及其機(jī)制的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［12］呂衛(wèi)光，張春蘭，袁飛，等.有機(jī)肥減輕連作黃瓜自毒作用的機(jī)制［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，18（2）：52-56.

［13］李紅麗，郭夏麗，李清飛，等.抑制煙草青枯病生物有機(jī)肥的研制及其生防效果研究［J］.土壤學(xué)報，2010，47（4）：798-801.

［14］凌寧，王秋君，楊興明，等.根際施用微生物有機(jī)肥防治連作西瓜枯萎病研究［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2009，15（5）：1136-1141.

［15］陳巧玲，胡江，汪漢成，等.生物有機(jī)肥對盆栽煙草根際青枯病原菌和短短芽孢桿菌數(shù)量的影［J］．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（1）：75-79.

［16］薛超，黃啟為，沈其榮，等．連作土壤微生物區(qū)系分析、調(diào)控及高通量研究方法［J］．土壤學(xué)報，2011，48（3）：612-618.